的方式收集病毒；
[0048] c)扩增
[0049] 用上一步骤收集的病毒，继续感染高表达ABCB4基因的细胞系，进行扩增。
[0050] 优选地，步骤a)中，腺病毒载体质粒为pHBAd-U6-GFP。pHBAd-U6-GFP质粒序列如 SEQ ID N0. :7 所示。
[0051] 优选地，步骤a)中，转染体系包括：重组腺病毒载体质粒pHBAd-U6-GFP、骨架质粒 pHBAd-BHG、和 Lipofiter?脂质体。pHBAd-BHG 质粒序列如 SEQ ID N0. :8 所示。
[0052] 优选地，步骤c)中，至少扩增两次。
[0053] 技术效果
[0054] 使用本发明的技术方案进行腺病毒的包装，总病毒颗粒数提高了约60%，感染性 滴度提高了约10倍，说明本发明的技术方案特别适用于对腺病毒的高效制备。
[0055] 以下将结合附图对本发明的构思、具体结构及产生的技术效果作进一步说明，以 充分地了解本发明的目的、特征和效果。
【附图说明】
[0056] 图 1 显示了 pHBLV-CMVIE-IRES-puro 载体图谱。
[0057] 图2显示了 ABCB4基因的PCR扩增结果。
[0058] 图3A显示了 ABCB4慢病毒载体构建后的PCR电泳结果；图3B显示了 ABCB4慢病 毒载体酶切鉴定的结果。
[0059] 图4显示了包装好的慢病毒感染293A细胞及WB验证的结果。图4A为对照病毒 (左图）和过表达ABCB4目的病毒感染293A细胞（右图），显示病毒成功包装并感染293A 细胞。图4B为ABCB4慢病毒感染293A细胞后wb鉴定结果。
[0060] 图5显示了重组腺病毒载体pHBAd-U6-GFP质粒图谱。
【具体实施方式】
[0061] AdMax包装系统中，腺病毒的重组和包装是将克隆了外源基因的腺病毒穿梭质粒 与携带了腺病毒大部分基因组的包装质粒共转染293A细胞，利用Cre/loxP系统的作用实 现重组，产生重组腺病毒。那么293A细胞的状态和功能对于腺病毒的产毒效率，起到了非 常关键的作用。经过发明人深入的研宄，意外地发现，通过对293A细胞中的ABCB4基因的 表达水平进行调控，能够使得腺病毒的产毒效率得到极大的提升。
[0062] ABCB4 基因
[0063] 人ABCB4位于7q21. 1，属于ABC转运家族。ABCB4基因主要在肝脏毛细胆管膜上 高度表达，编码多药耐药蛋白3(multidrug resistance protein 3，MDR3)，由ABCB4基因 编码翻译的P糖蛋白（P glycoprotein，PgP)Pgp3,主要在肝脏表达，是ABC(ATP binding cassette，ABC)转运体家族的成员之一。肝细胞外排各种化合物的过程几乎都由ABC 家族成员完成。MDR3、PgP3的作用是充当依赖ATP的磷脂弹跳酶的角色，将磷脂酰胆碱 (phosphatidyl choline，PC)从肝小叶胆管膜内转运到膜外。ABCB4基因的突变可能会导 致胆管损伤，从而引起胆汁淤积，继而引起多种疾病的发生。
[0064] 本发明中优选的ABCB4目的序列如下：
[0065] >lcl|BC042531. l_cdsid_AAH42531. 1[gene = ABCB4][protein = ATP-binding cassette, sub-family B(MDR/TAP), member 4][protein_id = AAH42531. 1][location = 113..3973]
[0066]
【主权项】
1. 一种分离的细胞或细胞系，其特征在于，所述细胞高表达ABCB4基因。
2. 如权利要求1所述的细胞或细胞系，其特征在于，所述细胞是包含外源的ABCB4基因 的细胞。
3. 如权利要求1所述的细胞或细胞系，其特征在于，所述细胞中还包含腺病毒载体。
4. 如权利要求1所述的细胞或细胞系，其特征在于，所述细胞或细胞系为293A细胞或 293A细胞系；优选地，所述细胞：（a)具有含有ABCB4基因的载体；或者（b)基因组中整合 有外源的ABCB4基因。
5. 如权利要求4所述的细胞或细胞系，其特征在于，所述含有ABCB4基因的载体以 pHBLV-CMVIE-IRES-puro质粒为骨架；和/或，所述腺病毒载体为pHBAd-U6-GFP质粒。
6. -种高效制备腺病毒的方法，其特征在于，所述方法包括步骤： (1) 制备高表达ABCB4基因的细胞； (2) 用高表达ABCB4的细胞扩增腺病毒。
7. 如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述步骤（1)中所述细胞为293A细胞。
8. 如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述步骤（1)中所述制备高表达ABCB4基因 的细胞的方法包括步骤： a) 构建ABCB4慢病毒载体； b) 慢病毒包装； c) 将包装好的慢病毒感染293A细胞； 优选地，构建ABCB4慢病毒载体过程中扩增ABCB4基因所使用的引物序列如SEQID NO. :2 和SEQIDNO. :3 所示。
9. 如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述步骤b)中，病毒包装系统包括质粒 pSpax2、pMD2G和ABCB4慢病毒载体；优选地，步骤b)中，慢病毒包装细胞为293T细胞； 更优选地，步骤b)中，慢病毒包装过程为： 培养293T细胞，胰酶消化后，加入pSpax2、pMD2G和ABCB4慢病毒载体组成脂转体系， 转染后收集病毒。
10. 如权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤2)中，用高表达ABCB4的细胞扩增腺 病毒的方法包括步骤： a) 转染 将重组腺病毒载体质粒转染步骤1)中获得的高表达ABCB4基因的细胞系； b) 收毒 转染后，采用反复冻融的方式收集病毒； c) 扩增 用上一步骤收集的病毒，继续感染高表达ABCB4基因的细胞系，进行扩增。
【专利摘要】本发明公开了一种高效表达腺病毒的细胞、及制备腺病毒的方法，经过发明人深入的研究，意外地发现，通过对293A细胞中的ABCB4基因的表达水平进行调控，能够使得腺病毒的产毒效率得到极大的提升。使用本发明的技术方案进行腺病毒的包装，总病毒颗粒数提高了约60％，感染性滴度提高了约10倍，说明本发明的技术方案特别适用于对腺病毒的高效制备。
【IPC分类】C12N15-12, C12N5-10, C12R1-93, C12N15-867, C12N7-00
【公开号】CN104789533
【申请号】CN201510144423
【发明人】蔡晓龙, 陈意雄, 邹杰, 王丽莎, 朱鹏飞, 李明明, 杨龙飞, 许曼蒂, 万颖, 曹青, 卞正雅, 韦唯
【申请人】上海科维创生物科技有限公司
【公开日】2015年7月22日
【申请日】2015年3月30日