，来实现细胞对琥珀酸的足量生产。
[0033] 本领域可获得多种手段用于在本发明的真核细胞中过量表达编码酶的核苷酸序 列。具体地，可以通过提高细胞中编码酶的基因的拷贝数，例如通过在细胞的基因组中整合 额外的基因拷贝，通过量表达来自着丝粒载体、来自附加体多拷贝表达载体的基因，或者通 过引入包含多拷贝基因的（附加体）表达载体，来过量表达编码酶的核苷酸序列。优选地， 用（强）组成型启动子实现根据本发明的酶的过量表达。
[0034]本发明还涉及包含选自SEQIDN0:7、SEQIDN0:8、SEQIDN0:9或SEQIDN0:10 构成的组的一种或多种核苷酸序列的核苷酸构建体。
[0035] 编码酶的核苷酸序列可以是质粒，例如低拷贝质粒或高拷贝质粒。根据本发明的 真核细胞可包含单个、但是优选地包含多个拷贝的编码NAD(H)依赖型延胡索酸还原酶的 核苷酸序列，例如通过多拷贝的核苷酸构建体来实现。
[0036] 核酸构建体可以保持为附加体，并因此包含用于自主复制的序列，例如常染色 体复制序列。如果真核细胞是真菌来源的，则合适的附加体核酸构建体可例如基于酵 母 2y或pKDl质粒（Gleer等，1991，Biotechnology9:968-975)或AMA质粒（Fierro 等，1995,CurrGenet. 29:482-489)。或者，可以将每种核酸构建体以一个或多个拷贝整合 进真核细胞的基因组中。进入细胞基因组的整合可以通过非同源重组随机发生，但是优选 地，可以如本领域所公知的，通过同源重组将核酸构建体整合进细胞的基因组中。
[0037]编码NAD(H)_依赖型延胡索酸还原酶的核苷酸序列可以是异源或同源的核苷酸 序列。优选地，NADH-依赖型延胡索酸还原酶是异源酶，其可以来自任何来源，例如细菌、真 菌、原生动物或植物。优选地，根据本发明的细胞包含异源的NAD(H)-依赖型延胡索酸还原 酶，所述酶优选地来自Trypanosomasp，例如来自Trypanosomabrucei〇
[0038] 在一个优选的实施方案中，编码NAD(H)-依赖型延胡索酸还原酶的核苷酸序列在 胞质溶胶中表达。令人惊讶的是，酶的胞质溶胶活性导致真核细胞对琥珀酸的提高的生产 力。
[0039] 在编码NAD(H)-依赖型延胡索酸还原酶的核苷酸序列包含过氧化物酶体或线粒 体靶向信号的情况下，为了防止酶的过氧化物酶体或线粒体靶向，可能必须修饰或缺失大 量氨基酸（和编码核苷酸序列中相应的核苷酸序列）。过氧化物酶体靶向信号的存在可例 如通过SchlUter等，NucleicacidResearch2007, 35,D815-D822 公开的方法测定。
[0040] 优选地，NAD(H)-依赖型延胡索酸还原酶缺少编码核苷酸序列表达后酶的胞质溶 胶活性所需的过氧化物酶体或线粒体靶向信号。
[0041] 优选地，细胞表达编码催化琥珀酸形成的酶的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列 优选地编码NAD(H)-依赖型延胡索酸还原酶，优选地编码包含下述氨基酸序列的延胡索酸 还原酶，所述氨基酸序列与SEQIDN0:3和/或SEQIDN0:6的氨基酸序列具有至少40%、 优选地至少 45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、 99%的序列同一性。优选地，核苷酸序列编码包含SEQIDN0:3和/或SEQIDN0:6的氨 基酸序列的NAD(H)-依赖型延胡索酸还原酶。
[0042] 选自酵母和丝状真菌的真核细胞优选地属于以下属之一 ：Saccharomyces、 Aspergillus、Penicillium、Pichia、Kluyveromyces、Yarrowia、Candida、 Hansenula、Humicola、Rhizopus、Torulaspora、Trichosporon、Brettanomyces、 Zygosaccharomyces、Pachysolen或Yamadazyma〇 更优选地，真核细胞是Saccharomyces cervisiae、Saccharomycesuvarum、Saccharomycesbayanus、Aspergillusniger、 Penicilliumchrysogenum、Pichiastipidis、Kluyveromycesmarxianus、K.lactis、 K.thermotolerans、Yarrowialipolytica、Candidasonorensis、C.glabrata、Hansenula polymorpha、Torulasporadelbrueckii、Brettanomycesbruxellensis、Rhizopusorizae 或Zygosaccharomycesbailii〇
[0043] 除了编码催化延胡索酸转化成琥珀酸的NAD(H)_依赖型延胡索酸还原酶的核苷 酸序列以外，根据本发明的重组真核细胞可包含其它遗传修饰，例如同源核苷酸序列中的 突变、缺失或断裂，和/或用编码同源或异源的下述酶的核苷酸序列转化，所述酶在细胞中 催化反应，导致提高的朝向琥珀酸的通量。例如可有利地引入、遗传修饰和/或过量表达下 述异源和/或同源核苷酸序列，所述核苷酸序列编码i)催化磷酸烯醇丙酮酸或丙酮酸转化 成草酰乙酸的酶；ii)催化从0AA转化成苹果酸的苹果酸脱氢酶；或iii)催化苹果酸转化 成延胡索酸的延胡索酸酶。
[0044] 可以用催化C3到C4碳分子反应的任何合适的核苷酸序列转化或遗传修饰真核细 胞，所述反应例如为磷酸烯醇丙酮酸（PEP，C3)到草酰乙酸（0AA，C4)和丙酮酸（C3)到0AA 或苹果酸（C3)。合适的酶是催化PEP转化成0AA的PEP羧激酶（EC4. 1. 1. 49,EC4. 1. 1. 38) 和PEP羧化酶（EC4. 1. 1. 31);催化丙酮酸反应成为0AA的丙酮酸羧化酶（EC6. 4. 1. 1.); 或催化丙酮酸反应成为苹果酸的苹果酸酶（EC1. 1. 1. 38)。
[0045] 优选地，根据本发明的真核细胞过量表达下述核苷酸序列，所述核苷酸序列编码 丙酮酸羧化酶（PYC)，优选地编码在编码PYC的核苷酸序列表达后在胞质溶胶中有活性的 丙酮酸羧化酶，例如包含根据SEQIDNO: 41的氨基酸序列的PYC。优选地，过量表达内源或 同源的丙酮酸羧化酶。惊讶地发现，过量表达内源丙酮酸羧化酶导致根据本发明的真核细 胞具有提高的琥珀酸生产水平。
[0046] 在另一个优选的实施方案中，根据本发明的真核细胞还包含编码异源PEP羧激 酶（EC4. 1. 1.49)的核苷酸序列，所述PEP羧激酶催化磷酸烯醇丙酮酸成为草酰乙酸的反 应。惊讶地发现，与不包含异源PEP羧激酶的真核细胞相比，还包含异源PEP羧激酶的根 据本发明的真核细胞生产琥珀酸的量有所提高。优选地，PEP羧激酶来自于细菌，更优选 具有PEP羧激酶活性的酶来自于Escherichiacoli、Mannheimiasp.、Actinobacillus sp.或Anaerobiospirillumsp.，更优选地来自于Mannheimiasucciniciproducens、 Actinobacillussuccinogenes或Anaerobiospirillumsucciniciproducens。优选地， 在编码PEP羧激酶的核苷酸序列表达后PEP羧激酶在胞质溶胶中有活性，因为发现这导致 提高的瑭泊酸生产。在一个实施方案中，对Actinobacillussuccinogenes的PEP羧激酶 (PCKa)进行修饰，用DAF氨基酸序列代替120-122位的EGY。优选地，根据本发明的真核细 胞包含与SEQIDN0:14或SEQIDN0:17具有至少80%、85%、90%、95%或99%序列同一 性的PEP羧激酶，优选地，含有SEQIDN0:14或SEQIDN0:17的PEP羧激酶。惊讶地发现， 本文所述PYC和PEP羧激酶的相伴（过量）表达导致琥珀酸生产至少1. 5的提高。
[0047] 在另一个优选的实施方案中，根据本发明的细胞还包含下述核苷酸序列，所述核 苷酸序列编码在核苷酸序列表达后在胞质溶胶中有活性的苹果酸脱氢酶（MDH)。胞质溶胶 MDH可以是任何合适的同源或异源苹果酸脱氢酶。所述MDH可以是S.cerevisiaeMDH3或 S.cerevisiaeMDH1。优选地，所述MDH缺乏过氧化物酶体或线粒体祀向信号，从而将酶定 位于胞质溶胶中。或者，所述MDH是已经修饰的S.cerevisiaeMDH2,从而其在存在葡萄糖 时不失活，并且在胞质溶胶中有活性。已知向葡萄糖-饥饿的细胞中添加葡萄糖后MDH2的 转录被阻抑并且Mdh2p降解。缺失最初12个氨基端氨基酸的Mdh2p对葡萄糖诱导的降解 更不易感（Minard和McAlister-Henn，JBiolChem.l992Aug25;267(24):17458-64)。优 选地，根据本发明的真核细胞包含编码下述苹果酸脱氢酶的核苷酸序列，所述苹果酸脱氢 酶与SEQIDN0:19或SEQIDN0:21的氨基酸序列具有至少70%，优选地至少75%、80%、 85%、90%、92%、94%、95%、96%、97%、98%、99%的序列同一性。优选地，所述苹果酸脱 氢酶包含SEQIDN0:19或SEQIDN0:21。优选地，通过本领域已知的方法过量表达编码核 苷酸序列，来提高苹果酸脱氢酶的活性。
[0048] 优选地，根据本发明的真核细胞还包含编码催化苹果酸转化成延胡索酸的酶的核 苷酸序列，所述酶可以是异源或同源酶，例如延胡索酸酶（FUM)。编码催化苹果酸转化成 延胡索酸的异源酶的核苷酸序列可来自于任何合适的来源，优选地来自微生物来源，优选 地来自酵母例如Saccharomycescerevisiae或丝状真菌例如Rhizopusoryzae。优选地， 根据本发明的真核细胞包含编码下述延胡索酸酶的核苷酸序列，所述延胡索酸酶与SEQID N0:23的氨基酸序列具有至少70%，优选地至少75%、80%、85%、90%、92%、94%、95%、 96%、97%、98%或99%的序列同一性，优选地为包含SEQIDN0:23的延胡索酸酶。优选地， 在编码具有延胡索酸酶活性的酶的核苷酸序列表达后，具有延胡索酸酶活性的酶在胞质溶 胶中有活性。惊讶地发现，还包含具本文所述具有延胡索酸酶活性的酶的真核细胞生产琥 I白酸的量有所提尚。
[0049] 在另一个实施方案中，根据本发明的真核细胞包含下述核苷酸序列，所述核苷酸 序列编码二羧酸转运蛋白，优选地编码苹果酸转运蛋白（MAE)。二羧酸转运蛋白可以是同源 或异源的蛋白质。优选地，二羧酸转运蛋白是异源蛋白质。二羧酸转运蛋白可来自于任何合 适的生物，优选地来自于Schizosaccharomycespombe。优选地，二羧酸转运蛋白是与SEQ IDN0:36具有至少80%、85%、90%、95%或99%序列同一性的苹果酸转运蛋白〇\^)。优 选地，MAE包含SEQIDN0:36。惊讶地发现，与不包含二羧酸转运蛋白的真核细胞相比，还 包含本文所述二羧酸转运蛋白例如苹果酸转运蛋白的本发明真核细胞生产琥珀酸的量有 所提尚。
[0050] 本发明还涉及二羧酸转运蛋白例如苹果酸转运蛋白在真核细胞中提高琥珀酸生 产的用途。优选地，所述二羧酸转运蛋白来自于Schizosaccharomycespombe。
[0051] 在一个优选的实施方案中，根据本发明的真核细胞是包含下述核苷酸序列并如本 文所述过量表达丙酮酸羧化酶（PYC)的酵母，所述核苷酸序列编码NAD(H)-依赖型延胡索 酸还原酶、苹果酸还原酶、异源延胡索酸酶、异源PEP羧激酶和异源二羧酸转运蛋白，包括 上文的优选的实施方案。惊讶地发现，与单独包含任一核苷酸序列的酵母相比，包含编码本 文所述酶的核苷酸序列的本发明酵母生产琥珀酸的量有所提高。
[0052] 在另一个优选的实施方案中，根据本发明的真核细胞包含：与野生型细胞中酶的 活性相比，降低的将NAD(H)转化成NAD+的酶活性。
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