经密码子对优化的。
[0088] 图15 :pGBS415FUM_2的质粒图谱，其含有来自Rhizopusoryzae的延胡索酸酶 (FUMR)和最初12个氨基酸截短的来自Saccharomycescerevisiae的细胞质苹果酸脱氢 酶（A12NMDH2)(用于在Saccharomycescerevisiae中表达）。将合成基因构建体TDH1 启动子-FUMR-IDH1终止子和IDH3启动子-MDH3-IDH3终止子克隆进表达载体pRS415中。 CP0代表经密码子对优化的。
[0089] 图16 :pGBS415FUM_3的质粒图谱，其含有来自Rhizopusoryzae的延胡索酸酶 (FUMR)和来自Saccharomycescerevisiae的过氧化物酶体苹果酸脱氢酶（MDH3)(用于在 Saccharomycescerevisiae中表达）。将合成基因构建体TDH1启动子-FUMR-TDH1终止 子和TDH3启动子-MDH3-TDH3终止子克隆进表达载体pRS415中。CP0代表经密码子对优化 的。
[0090]图 17:菌株SUC-101 (0,空载体对照）、SUC-148 ( ，PCKa、MDH3、FUMR、FRDml的过 量表达）、SUC-149 ( 口，PCKa、MDH3、FUMR、FRDg)、SUC-150 (?，PCKm、MDH3、FUMR、FRDml)、 SUC-151 (?，PCKm、MDH3、FUMR、FRDg)、SUC-152( ?，PCKa、MDH3、FUMR)、SUC-154(X， PCKm、MDH3、FUMR)和SUC-169( ▲，PCKm、A12NMDH2、FUMR、FRDml)中的琥珀酸水平。针 对在S.cerevisiae中的表达对所有过量表达的基因进行了密码子对优化。所有数据代表 5此-148、149、150、151、152、154和5此-169的3个独立生长实验和5阢-101的6个独立生 长实验的均值。
[0091]图 18 :pGBS416MAE_l的质粒图谱，其含有来自Schizosaccharomycespombe的苹 果酸通透酶（SpMAEl)(用于在Saccharomycescerevisiae中表达）。将合成基因构建体 Enol启动子-MAEl-Enol终止子克隆进表达载体pRS416中。CPO代表经密码子对优化的。
[0092]图 19 :菌株SUC-101 (0,空载体对照）、SUC-169( 口，PCKm、A12NMDH2、FUMR、FRDml) 和SUC-194(_，A12NMDH2、FUMR、FRDml、SpMAEl)中的琥珀酸水平。针对在S.cerevisiae 中的表达对所有过量表达的基因进行了密码子对优化。所有数据代表SUC-169和SUC-194 的3个独立生长实验和SUC-101的6个独立生长实验的均值。
[0093]图20:菌株SUC_103(0,adhl/2和gpdl缺失突变体；空载体对照）、SUC-201 (口， &(1111/2和§口(11缺失突变体；？〇^、]\?113、？通1?、？1^^)和5此-200(_，3(1111/2和 §口(11缺失 突变体；PCKa、MDH3、FUMR、FRDg、SpMAEl)中的琥珀酸水平。针对在S.cerevisiae中的表 达对所有过量表达的基因进行了密码子对优化。
[0094]图 21 :pGBS426PYC_2 的质粒图谱，其含有来自Saccharomycescerevisiae的丙酬 酸羧化酶（用于在Saccharomycescerevisiae中表达）。使用来自菌株CEN.PK113-?的 基因组DNA作为模板，通过PCR获得编码PYC2的核苷酸序列，并将PCR产物克隆进表达载 体P426GPD中。
[0095] 图22 :pGBS414FRE_l的质粒图谱，其编码来自Trypanosomabrucei的糖酵解酶体 延胡索酸还原酶（FRDg)(用于在Saccharomycescerevisiae中表达）。将合成基因构建体 TDH3启动子-FRDg-TDH3终止子克隆进表达载体pRS414中。
[0096]图 23 :菌株SUC-226 (口，PCKa、MDH3、FUMR、FRDg)、-227 ( ▲，PYC2、PCKa、MDH3、 FUMR、FRDg)、SUC-228 ( ，PYC2、MDH3、FUMR、FRDg)和SUC-230 (0,MDH3、FUMR、FRDg)中的 琥珀酸水平。数据代表3个独立生长实验的均值。
【具体实施方式】
[0097] 实施例
[0098] 实施例1:在Aspergillusniger中克降来自Trypanosomabrucei的延古月索酸还 原酶
[0099] 1. 1?表达构建体
[0100]使用SignalP3.0 (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)Bendtsen，J. 等（2004)M〇1.Biol. ,340:783-795 和TargetPl.l(http://www.cbs.dtu.dk/ services/TargetP/)Emanuelsson, 0?等（2007)NatureProtocols2,953-971，针对 信号序列的存在，分析来自Trypanosomabrucei的线粒体延胡索酸还原酶ml(FRDml) [E.C. 1. 3. 1. 6],GenBank查询号60460035。鉴定了蛋白质N-端一半中推定的线粒体革巴向 序列，其在25和26位之间包含可能的切割位点（D-S)。
[0101] 显示：缺少68个N-端残基的FRDml重组蛋白质重新定位于procyclic trypanosomes的胞质溶胶中（Coustou等，JBiolChem. 2005Apr29;280 (17): 16559-70)。 这些结果表明FRDml的预测的N-端信号基序是靶向至线粒体所需要的。从SEQIDNO: 1(对 应于核苷酸序列SEQIDN0:2)中去除最初68个氨基酸并再引入新的甲硫氨酸氨基酸，得 到5￡〇10勵:3。如恥2008/000632中所公开的，针对4 111861'对5￡〇10勵:3进行密码子 对方法。将得到的序列SEQIDN0:7置于组成型GPDA启动子序列SEQIDN0:11之后，其 中用最优的Kozak序列CACCGTAAA替换最后10个核苷酸序列。添加便利的限制性消化位 点。将SEQIDN0:7中的终止密码子TAA修饰为TAAA。在Sloning(Puchheim，德国）合 成得到的序列。使用适当的限制性消化位点将片段SnaBI、Sfil克隆进A.niger表达载体pGBTOPH(图1)中。将得到的包含FRDml的质粒称作pGBTOPAnl(图5)。
[0102] 类似地，使用具有真菌特异性预测功能的PTS1预测器http: //mendel.imp. ac.at/mendeljsp/sat/ptsl/PTSlpredictor.jsp分析来自Trypanosomabrucei的糖酵 解酶体延胡索酸还原酶（FRDg) [E.C. 1. 3. 1. 6]，GenBank查询号23928422在丝状真菌中 的过氧化物酶体靶向。从蛋白质SEQIDN0:4(对应于核苷酸序列SEQIDN0:5)中去除 1140-1142 位的C-端氨基酸（SKI)，得到SEQIDNO: 6。针对A.niger对SEQIDNO: 6 进行 如PCT/EP2007/05594中所公开的密码子对方法。将SEQIDN0:8中的终止密码子TAA修 饰为了444。将得到的序列3￡〇10勵:8置于组成型6?04启动子序列3￡〇10勵：11之后， 并添加便利的限制性消化位点。在Sloning(Puchheim，德国）合成得到的序列。使用适当 的限制性消化位点将片段SnaBI、Sfil克隆进A.niger表达载体pGBTOPH(图1)中。
[0103] 1. 2.A.niger的转化
[0104]A.nigerWT-1 :该A.niger菌株是包含编码葡糖淀粉酶（glaA)、真菌淀粉酶和酸 性淀粉酶的基因缺失的CBS513. 88。通过使用如EP0 635 574B1中所述的"无标记物基 因"（〃MARKER-GENEFREE〃）途径构建A.nigerWT-1。
[0105]根据Tilburn,J?等（1983)Gene26, 205-221和Kelly,J.&Hynes，M. (1985)EMB0 J.，4, 475-479中所述方法，使用以下修饰用表达构建体共转化菌株A.nigerWT-1:
[0106]-在Aspergillus最小培养基（100ml)中，在置于300rpm旋转摇床中的摇瓶中， 在30°C下使孢子萌发并培养16小时。每升Aspergillus最小培养基含有：6gNaN03、0. 52g KCl、1.52gKH2P04、1.12ml4MK0H、0.52gMgS04.7H20、10g葡萄糖、lg水解酪蛋白氨基酸、 22mgZnS04.7H20、llmgH3B03、5mgFeS04.7H20、1.7mgCoCl2.6H20、1.6mgCuS04.5H20、5mg MnCl2. 2H20、1. 5mgNa2Mo04. 2H20、50mgEDTA、2mg核黄素、2mg硫胺-HCl、2mg烟酰胺、lmg 吡哆醇_HCL、0.2mg泛酸、4g生物素、10ml青霉素（5000IU/ml)、链霉素（5000UG/ml)溶液 (Gibco)〇
[0107]-使用Novozym234?(NovoIndustries)代替螺旋酶来制备原生质体；
[0108]-原生质体形成（60-90分钟）后，添加KC1缓冲液（0.8MKCl、9.5mM柠檬酸， pH6. 2)至45ml的终体积，将原生质体悬浮液在4°C下于摆动桶转子（swinging-bucket rotor)中3000rpm离心10分钟。将原生质子重悬于20mlKC缓冲液中，随后添加25mlSYC 缓冲液（1.2M山梨糖醇、10mMTris-HClpH7. 5,50mMCaCl2)。将原生质体悬浮液在4°C下 于摆动桶转子中3000rpm离心10分钟，在STC-缓冲液中洗涤，并以10E8原生质体/ml的 浓度重悬于STC-缓冲液中；
[0109]-向200微升原生质体悬浮液中，添加溶于100微升TE缓冲液（10mMTris-HClpH 7. 5, 0?ImMEDTA)中的DNA片段和 100 微升PEG溶液（20%PEG4000(Merck)、0?8M山梨糖 醇、lOmMTris-HClpH7. 5、50mMCaCl2)。
[0110] -将DNA-原生质体悬浮液在室温下孵育10分钟后，缓慢添加1. 5mlPEG溶液 (60%PEG4000(Merck)、10mMTris-HClpH7.5、50mMCaCl2)，期间对管加以重复混合。 在室温下孵育20分钟后，用5ml1. 2M山梨糖醇稀释悬浮液，通过翻转混合，并在室温下于 4000rpm离心10分钟。将原生质体柔和地重悬于lml1. 2M山梨糖醇中，并置于固体选择性 再生培养基上，所述培养基由的任一Aspergillus最小培养基（不含核黄素、硫胺、HC1、烟 酰胺、吡唆醇、泛酸、生物素、水解酪蛋白氨基酸和葡萄糖）组成。在乙酰胺选择的情况下， 培养基含有10mM乙酰胺作为唯一氮源，以及1M蔗糖作为渗压剂和C-源。或者将原生质体 涂布在下述PDA(马铃薯葡萄糖琼脂，Oxoid)上，所述PDA补充有1-50微克/ml腐草霉素 和1M蔗糖作为渗压剂。使用2%琼脂（琼脂No.l，0xoidL11)固化再生平板。在30°C孵 育6-10天后，将转化体的分生孢子转移至由含2%葡萄糖和1. 5%琼脂糖（Invitrogen)的 Aspergillus选择性培养基（在乙酰胺选择的情况下含有乙酰胺作为唯一氮源的最小培养 基，或在腐草霉素选择的情况下补充有1-50微克/ml腐草霉素的PDA)构成的平板上，并在 30