橄榄色盾壳霉、尖孢镰刀菌、灰葡萄孢、 禾谷丝核菌、绿色木霉等）等均具有较好的抑制作用。
【附图说明】
[0016] 图1菌株LM3403菌落形态。
[0017] 图2菌株LM3403美兰染色。
[0018] 图3菌株LM3403抗菌脂肽合成酶基因扩增电泳图。
【具体实施方式】
[0021] 以下通过实施例对本发明作进一步的阐述。
[0022] 实施例1 :广谱抑菌菌株LM3403的分离筛选 采集海拔3000米以上高寒无污染草原上生长的野牦牛牛粪样品。准确称取样品25g， 放入装有玻璃珠和225mL无菌水的三角瓶中，振荡30min，得到样品悬液。在无菌条件下，用 无菌水对样品悬液进行梯度稀释，得到不同稀释度的稀释液。分别吸取各稀释度的样品悬 液0.lmL均匀涂布于NA平板上，30°C恒温培养24-36h后，观察长出菌落的形态、颜色、透明 度等特征，挑取形态差异明显的菌落进行划线纯化、编号、保存备用。
[0023] 采用滤纸片法考察待测细菌菌株对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑制能力，采用 平板对峙培养法考察待测细菌菌株对病原真菌的抑制能力。将得到的广谱抗菌能力最强的 菌株命名为LM3403。
[0024] 实施例2:菌株LM3403种属鉴定 参照《常见细菌系统鉴定手册》进行菌株形态学观察和生理生化特性分析。菌株LM3403 在NA平板上菌落圆形、不透明乳白色、较黏稠、边缘不整齐(见图1);细胞呈杆状，革兰氏阳 性，芽孢中生、椭圆形(见图2)。需氧生长：阳性，运动性：阳性，V-P试验：阳性，过氧化氢酶 试验：阳性，吲哚试验：阳性，淀粉水解：阳性，酪蛋白水解：阳性，明胶液化：阳性，葡萄糖发 酵试验：阳性，硝酸盐还原：阳性，尿素利用：阳性，菌株LM3403的形态特征、生理生化特征 与枯草芽孢杆菌标准株保持一致。
[0025] 利用细菌基因组DNA提取试剂盒提取菌株基因组DNA，以通用引物27F和1492R 为引物，对菌株16SrDNA进行PCR扩增。PCR产物经0.8%的琼脂糖凝胶电泳检测后送交 上海生工生物工程有限公司纯化测序。将测序结果与GenBank数据库中已知的16SrDNA 序列进行BLAST比对。菌株PCR产物经纯化后测序得到1439bp的序列（GenBank登录号 KJ906613)，经BLAST比对，发现菌株LM3403 的 16SrDNA序列与 strain SPAstrainME2(JQ900623)和 strain BDT3(HQ711982)的同源性达到 100%。
[0026] 综合分析确定菌株LM3403为枯草芽孢杆菌。
[0027] 实施例3 :菌株LM3403抗菌脂肽提取 将菌株发酵液于4 °C、12000rpm离心15min，收集无菌上清液；用6mo1/L的HC1将 无菌上清液调至pH2.0,4°C静置过夜后12000r/min、4°C离心15min，收集沉淀；向沉淀中 加入适量甲醇，于磁力搅拌器上搅拌30min后，放入4°C冰箱内静置抽提8h，抽提结束后 4°C、12000rpm离心15min，得到甲醇抽提液。经减压浓缩、真空冷冻干燥后，得到抗菌物 质，-20°C保存。取真空冷冻干燥后的抗菌物质，溶于pH7. 0的磷酸缓冲液中，配制成一定浓 度的抗菌物质溶液，4 °C保存备用。
[0028] 实施例4 :菌株LM3403抗菌脂肽合成酶基因扩增 利用细菌基因组DNA提取试剂盒提取菌株基因组DNA，以表1中所列引物进行菌株LM3403抗菌脂肽合成酶基因的PCR扩增，PCR完成后经0. 8%的琼脂糖凝胶电泳检测。 基因PCR条件：94°C预变性5min;94°C变性lmin，43°C退火30s，72°C延伸lmin，30个循环； 72°C延伸lOmin。基因PCR条件：94°C预变性 5min;94°C变性lmin，50°C退火 30s，72°C 延伸1. 5min，30个循环；72°C延伸lOmin。基因PCR条件：94°C预变性5min;94°C变性 lmin，48°C退火30s，72°C延伸1. 5min，33个循环；72°C延伸lOmin。如图3所示，sZ/t基因、 基因、基因均扩增成功，说明菌株LM3403具有合成Surfactin、Fengycin、Iturin 的能力。
[0029] 表1抗菌脂肽合成酶基因引物信息表
【主权项】
1. 一株联产抗菌脂肽和γ-聚谷氨酸的菌株，该菌株为枯草芽孢杆菌 5·?6?27Υ?5·)?Ο403,已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为 CGMCC No. 9377。
2. 权利要求1所述的菌株LM3403在制备和应用抗菌脂肽方面的应用。
3. 权利要求1所述的菌株LM3403在制备和应用γ -聚谷氨酸方面的应用。
4. 权利要求1所述的菌株LM3403在微生物饲料、饲料添加剂等方面的应用。
5. 权利要求1所述的菌株LM3403在微生物肥料、植物病害防治等方面的应用。
6. 权利要求1所述的菌株LM3403在食品、化妆品等方面的应用。
7. 权利要求1所述的菌株LM3403在医药、环保等方面的应用。
【专利摘要】本发明属于微生物技术领域，公开了一株能够联产多种抗菌脂肽和γ-聚谷氨酸的芽孢杆菌菌株。该菌株为枯草芽孢杆菌LM3403，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.9377。该菌株具有联产Surfactin、Fengycin、Iturin三种抗菌脂肽和γ-聚谷氨酸的能力，可用于制备抗菌脂肽和γ-聚谷氨酸，可应用于微生物饲料、饲料添加剂、微生物肥料、植物病害防治、食品防腐保鲜、化妆品、医药、环保等领域，具有十分巨大的应用价值和市场开发潜力。本发明的枯草芽孢杆菌菌株LM3403优点在于：具有联产Surfactin、Fengycin、Iturin三种抗菌脂肽和γ-聚谷氨酸的能力，有利于降低生产成本、提高生产效率和拓宽应用范围，具有巨大的应用价值和市场开发潜力。CGMCC No.937720140625
【IPC分类】C12P13-02, C05F11-08, A01N63-00, C12N1-20, A01P1-00, C12R1-125, A23K1-16, C12P21-00, A01P3-00
【公开号】CN104830713
【申请号】CN201510165243
【发明人】陈亮
【申请人】河南工业大学
【公开日】2015年8月12日
【申请日】2015年4月9日