丁质酶菌株（Pseudoalteromonas sp. ) DL-6的菌落形态特征(如 图1):
[0064] 菌落为淡黄色、不透明、表面光滑、边缘整齐、易挑取。通过简单染色、革兰氏染色、 荚膜染色、芽孢染色等方法对该菌株生物学特性进行初步鉴定，结果表明该菌株为细菌，其 形状为杆状、0. 1-0. 5 μ mX 1. 3-2. 0 μ m、革兰氏阴性、无荚膜、无芽孢、端生鞭毛。遗传学特 征：
[0065] 16S rDNA喊基序列；菌株16S rDNA全基因序列共1450bp (Genbank登录号为： KF208362)〇
[0066] 低温生产几丁质酶菌株 DL-6 (Pseudoalteromonas sp. DL-6) CGMCC NO. 8580 的 16S rDNA 序列。
[0067] I acgctggcgg caggcctaac acatgcaagt cgagcggtaa cagaaagtag cttgctactt
[0068] 61 tgctgacgag cggcggacgg gtgagtaatg cttgggaaca tgccttgagg tgggggacaa
[0069] 121 cagttggaaa cgactgctaa taccgcataa tgtctacgga ccaaaggggg cttcggctct
[0070] 181 cgcctttaga ttggcccaag tgggattagc tagttggtga ggtaatggct caccaaggcg
[0071] 241 acgatcccta gctggtttga gaggatgatc agccacactg ggactgagac acggcccaga
[0072] 301 ctcctacggg aggcagcagt ggggaatatt gcacaatggg cgcaagcctg atgcagccat
[0073] 361 gccgcgtgtg tgaagaaggc cttcgggttg taaagcactt tcagtcagga ggaaaggtta
[0074] 421 gtagttaata cctgctagct gtgacgttac tgacagaaga agcaccggct aactccgtgc
[0075] 481 cagcagccgc ggtaatacgg agggtgcgag cgttaatcgg aattactggg cgtaaagcgt
[0076] 541 acgcaggcgg tttgttaagc gagatgtgaa agccccgggc tcaacctggg aactgcattt
[0077] 601 cgaactggca aactagagtg tgatagaggg tggtagaatt tcaggtgtag cggtgaaatg
[0078] 661 cgtagagatc tgaaggaata ccgatggcga aggcagccac ctgggtcaac actgacgctc
[0079] 721 atgtacgaaa gcgtggggag caaacaggat tagataccct ggtagtccac gccgtaaacg
[0080] 781 atgtctacta gaagctcgga acctcggttc tgtttttcaa agctaacgca ttaagtagac
[0081] 841 cgcctgggga gtacggccgc aaggttaaaa ctcaaatgaa ttgacggggg cccgcacaag
[0082] 901 cggtggagca tgtggtttaa ttcgatgcaa cgcgaagaac cttacctaca cttgacatac
[0083] 961 agagaactta ccagagatgg tttggtgcct tcgggaactc tgatacaggt gctgcatggc
[0084] 1021 tgtcgtcagc tcgtgttgtg agatgttggg ttaagtcccg caacgagcgc aacccctatc
[0085] 1081 cttagttgct agcaggtaat gctgagaact ctaaggagac tgccggtgat aaaccggagg
[0086] 1141 aaggtgggga cgacgtcaag tcatcatggc ccttacgtgt agggctacac acgtgctaca
[0087] 1201 atggcgcata cagagtgctg cgaacctgcg aaagtaagcg aatcacttaa agtgcgtcgt
[0088] 1261 agtccggatt ggagtctgca actcgactcc atgaagtcgg aatcgctagt aatcgcgtat
[0089] 1321 cagaatgacg cggtgaatac gttcccgggc cttgtacaca ccgcccgtca caccatggga
[0090] 1381 gtgggttgct ccagaagtag atagtctaac cctcgggagg acgtttacca cggagtgatt
[0091] 1441 catgactggg
[0092] 实施例3
[0093] 交替假单胞菌（Pseudoalteromonas sp. ) DL-6 菌株 CGMCC :8580 的发酵工艺：
[0094] 1)将交替假单胞菌划线于固体培养基上，在4~30°C(在此可为20°C )培养48_96h (在此可为48h);
[0095] 2)按常规方法将低温几丁质酶产生菌在4~30°C (在此可为20°C，24h)逐级扩 大培养，制备成液体一级种子和二级种子；
[0096] 3)将液体一级种子或二级种子，按发酵液体积的1~9% (在此可为9%)接种量 接入液体发酵培养基中，在14~20°C (在此可为15°C)培养48~96h (在此可为96h)时， 即微生物发酵生产低温几丁质酶结束；
[0097] 4)将（3)的发酵液在4, 000~8, OOOg (在此可为5000g)离心收集液体，获取发 酵物；
[0098] 5)将（4)得到的发酵液经1000 Og离心10min去除菌体，上清液经60%饱和硫酸铵 在4°C搅拌过夜，12000g离心30min，收集沉淀，用PBS缓冲液（0. 02~0. 05M，pH7. 0-8. 0) (在此可为0. 02M，pH7. 2)重新溶解沉淀，再用相同缓冲液透析除盐，制备成液体酶制剂。
[0099] 6)该菌株低温发酵产几丁质酶活性（3, 5二硝基水杨酸法）高达9. 87U/mL。
[0100] 所述固体种子培养基：牛肉膏1.0 g ;胰蛋白胨5. Og ;琼脂粉15. Og ;海水I. 0L， 121<€高压蒸气灭菌3〇111；[11;
[0101] 所述液体种子培养基：牛肉膏1.(^;胰蛋白胨5.(^;海水1.(^，1211：高压蒸气灭 菌 30min ;
[0102] 所述发酵培养基：细粉几丁质5. Og ;蛋白胨5. Og ;海水I. 0L，121°C高压蒸气灭菌 30min〇
[0103] 实施例4
[0104] 低温几丁质酶生产菌株生长曲线测定
[0105] 将纯化后的平板，挑取单菌落接入液体种子培养基，作为种子液，15°C，160rpm振 荡培养24h后，1%接种液体种子培养基，15°C，160rpm振荡培养，每隔2-4h测定菌液OD 6tltol, 以空白培养基调零，约70h，绘制生长曲线(如图2)。
[0106] 图2.低温生产几丁质酶菌株的生长曲线该菌株延滞期为0~6h ;对数期为6~ 24h ;稳定期为24~60h，衰亡期为60~70h。
[0107] 实施例5
[0108] 低温生产几丁质酶菌株的产酶曲线
[0109] 挑取适量菌落于发酵培养基中，于15°C，160rpm培养，每隔两小时测定低温几丁 质酶酶活(如图3)。
[0110] 所述发酵培养基（g/L):胶体或细粉几丁质5. Og ;蛋白胨5. Og ;海水I. 0L，121°C高 压蒸气灭菌30min。
【主权项】
1. 一种低温生产几丁质酶的菌株，其特征在于：命名为低温生产几丁质酶菌株DL-6， 即Pseudoalteromonassp.DL-6,该菌株已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物 中心保藏，保藏单位名称：中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏日期：2013年12月13 日，其保藏编号为CGMCCNO. 8580。2. 按照权利要求1所述的菌株，其特征在于： 菌落形态特征为：菌落为淡黄色、不透明、表面光滑、边缘整齐、易挑取。通过简单染色、 革兰氏染色、荚膜染色、芽孢染色等方法对该菌株生物学特性进行初步鉴定，结果表明该菌 株为细菌，杆状、〇. 1-0. 5iimX1. 3-2. 0iim、革兰氏阴性、无荚膜、无芽孢、端生鞭毛； 遗传学特征： 所述低温生产几丁质酶菌株DL-6,即Pseudoalteromonassp.DL-6的16SrDNA全基因 碱基序列（表1);菌株16SrDNA全基因序列共1450bp(Genbank登录号为：KF208362)。3. -种采用权利要求1所述菌株低温生产几丁质酶的发酵方法，其特征在于： (1) 将所述菌株接种于固体种子培养基上，在4~30°C培养48-96h，制成固体种子； (2) 将几丁质酶生产菌在4~30°C于液体种子培养基中进行液体扩大培养，制备成液 体一级种子； 将液体一级种子进行或不进行于液体种子培养基中的液体扩大培养，将液体一级种子 于液体种子培养基中进行液体扩大培养制备成液体二级种子； (3) 将液体一级种子或二级种子，按发酵液体积的1~9%接种量接入液体发酵培养基 中，在14~20°C培养48~96h时，即微生物低温发酵生产几丁质酶结束； (4) 将（3)的发酵液在4, 000~8,OOOg离心收集液体，获取发酵物。4. 按照权利要求3所述的发酵方法，其特征在于： 根据不同需要和使用对象不同，将（4)得到的发酵物经1000 Og离心IOmin去除菌体， 上清液经60%饱和硫酸铵在4°C搅拌过夜，12000g离心30min，收集沉淀，用一定量的PBS缓 冲液（0. 02~0. 05M，pH7. 0-8. 0)重新溶解沉淀，再用相同缓冲液透析除盐，制备成液体酶 制剂。5. 按照权利要求3所述的发酵方法，其特征在于：其中固体种子培养基、液体种子培养 基、发酵培养基分别为： (1) 固体种子培养基：牛肉膏LOg;胰蛋白胨5.Og;琼脂粉15.Og;海水1.0L，121°C高 压蒸气灭菌30min; (2) 液体种子培养基：牛肉膏LOg;胰蛋白胨5.0g;海水1.0L，121°C高压蒸气灭菌 30min； (3) 发酵培养基：胶体或细粉几丁质5.Og;蛋白胨5.Og;海水I. 0L，121°C高压蒸气灭 菌 30min。6. 按照权利要求3所述的发酵方法，其特征在于： 步骤（1)和（2)培养低温生产几丁质酶最适温度为14~20°C。
【专利摘要】本发明涉及一种新交替假单胞菌属的海洋细菌，具体的说是一种低温生产几丁质酶的新菌及其发酵方法研究，命名为Pseudoalteromonas sp.DL-6，该菌株已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏单位名称：中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏日期：2013年12月13日，其保藏编号为CGMCC NO.8580。本发明对该菌发展了一套培养技术，能从该菌稳定发酵生产几丁质酶。CGMCC NO858020131213
【IPC分类】C12R1/01, C12N1/20, C12N9/42
【公开号】CN104893997
【申请号】CN201410078945
【发明人】尹恒, 王晓辉, 杜昱光, 迟乃玉, 李曙光, 曹海龙, 赵勇
【申请人】中国科学院大连化学物理研究所
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2014年3月5日