6. 8gNaHC〇3,溶 于900血d地2〇中，用1. 0M化OH调整抑至8. 0定容至1000血，高压灭菌，室温保存；
[0152] 3HTCBE购买自日本同仁化学研究所，货号M030 ;
[0153] 4)低密度脂蛋白溶液；称取4.Omg低密度脂蛋白溶于4. 0血0. 01MpH9. 0棚酸盐 缓冲液中，充分振荡溶解，配制成1.Omg/mL的低密度脂蛋白溶液；
[0154] 5)透析袋的截留分子量14000,购买自BioshopInc;
[0155] 透析袋的预处理；将透析袋放入500血的邸TA-NaHC〇3溶液中，煮沸lOmin;倾弃 邸TA-NaHC〇3溶液，用d地2〇轻轻漂洗，再用500血5mmol/L邸TA煮沸lOmin;弃掉煮沸液，彻 底用d地2〇清洗，加入大量的d地2〇浸泡透析袋4°C过夜。使用时，戴上手套，取出透析袋， 用大量的dd&O彻底冲洗其内外表面；
[0156] 制备铭-低密度脂蛋白馨合物的方法，包括W下步骤：
[0157] A)铭-低密度脂蛋白馨合物的合成；在提纯源于人体的低密度脂蛋白或按照生物 学方法重组的低密度脂蛋白中加入铭离子进行馨合反应，反应溶液，具体包括W下步骤：
[0巧8] 1)取 2.OmgITC邸溶于 2mLDMS0 中；
[0159] 2)缓慢将步骤1制备的液体加入低密度脂蛋白溶液中，边滴加边震荡，于25。 l(K)r/min的摇床中作用2化，然后用透析袋透析2化，除去未与低密度脂蛋白结合的 ITCBE；
[0160] 3)将透析所得的液体用Imol/L肥1调节抑值至7. 0,然后缓慢逐渐滴加80y1 Immol/L铭离子溶液，边滴加边振荡，W免铭离子使蛋白变性沉淀；
[016。 4)将加好的溶液在25°C，lOOr/min的摇床中反应化，用处理好的透析袋进行透析 2化；
[0162] 5)将透析好的液体于-20°C分装保存，得到铭-低密度脂蛋白馨合物的反应溶液。
[0163]B)铭-低密度脂蛋白馨合物纯化；采用免疫亲和层析法，去除步骤A)反应溶液中 未反应的低密度脂蛋白、特异性抗体和铭离子，即得铭-低密度脂蛋白馨合物，具体包括W 下步骤：
[0164] (1)溶解样品；将上述步骤A)的铭-低密度脂蛋白馨合物溶解于生理盐水中，得 铭-低密度脂蛋白馨合物的溶液；
[0165] (2)平衡层析柱；使用稀释缓冲液冲洗层析柱的管路，在层析柱中装入能与低密 度脂蛋白特异性结合的填料，装柱后，继续使用稀释缓冲液平衡层析柱；
[0166] (3)上样；待层析柱平衡后，用稀释缓冲液稀释步骤（1)的溶液，然后上柱，使低密 度脂蛋白与填料特异性结合；
[0167] (4)洗脱；使用稀释缓冲液冲洗层析柱至基线平衡，然后使用0. 05-0.lOmol/L的 化2册〇4溶液进行洗脱；
[016引 （5)收集；收集洗脱液，收集完毕后立即使蛋白复原；
[0169] (6)透析；将步骤巧）中的收集的洗脱液，装透析袋，用d地2〇透析除盐，换水S次 后，4°C透析过夜，收集样本；
[0170] (7)平衡层析柱；采用新的层析柱，用稀释缓冲液冲洗管路，在该层析柱中装入能 与铭特异性结合的填料，装柱后再用稀释缓冲液平衡层析柱；
[OW] 做上样；待层析柱平衡后，用稀释缓冲液稀释步骤做中样本，然后上柱；
[0172] (9)洗脱；使用稀释缓冲液冲洗层析柱至基线平衡，然后使用0. 5-1.Omol/L的 化2册〇4溶液进行洗脱；
[0173] (10)收集；收集洗脱液，收集完毕后立即使蛋白复原；
[0174] (11)透析；将步骤（10)中的收集的洗脱液，装透析袋，用(1化0透析除盐，换水S 次后，4 °C透析过夜，收集样本，即得铭-低密度脂蛋白馨合物。
[0175] C)对铭-低密度脂蛋白塞合物的鉴定，具体步骤如下：
[0176] (1)制备胶床；W琼脂糖凝胶作为介质制备胶床；
[0177] (2)加样；取步骤B)中提取纯化得到的铭-低密度脂蛋白馨合物，复溶于生理盐 水中，得铭-低密度脂蛋白馨合物的溶液，取8yL上述溶液，加入2yL上样缓冲液，并混 匀，然后加样于样品槽中；
[0178] (3)电泳；连接电泳板，加电泳缓冲液进行电泳；电泳过程中，电流为22mA恒流，环 境温度为4度；至漠酪藍移至胶底部时停止电泳，图1为本发明所述铭-低密度脂蛋白塞合 物的非变性电泳条带图；
[017引 （4)检测；在胶床上找出含铭的蛋白条带，将该蛋白条带取出，将蛋白条带溶解， 然后再采用ICP-MS或AAS检测是否含有铭W及检测铭的含量。
[0180] D)鉴定结果[01引]1)AAS检测结果
[0182] 取步骤C)分离出的蛋白条带溶液，W石墨炉原子吸收光谱法（AA巧初步测定低密 度脂蛋白中重金属铭的含量，如下表所示，W化Cl溶液、邸r溶液、KCl溶液为空白对照；
[0183] 表1低密度脂蛋白中铭的含量
[0184]
[0185] 2)同步福射X巧光分析
[0186] 蛋白条带内微量元素含量的SRXRF分析在北京正负电子对撞机任EPC)的4W1" 同步福射束线上完成。储存环中电子束流能量为2. 2GeV，束流强度100mA。样品移动台 (TSA200型，北京卓立汉光公司）可在计算机控制的步进马达驱动下沿X、Y二维方向上移 动W改变入射光斑位置，移动步长为0. 0025mm。从样品发射出的X射线由Si(Li)探测器 (PGTInc.LS30143-D巧探测，探头与入射SR线共平面且相互垂直，距样品照射点20mm，信 号用PGT多道分析仪（MCA4000)获取输出。用11.化eV的单色同步福射光激发样品，调节 入射光斑（lmmx3mm)位置使之处于条带一端，在300s的测定时间内，光斑一直沿条带均匀 缓慢移动，计数结束时光斑移到该条带另一端。沿电泳方向每1mm取一个谱。采用AXIL 软件处理数据，并用来源于空气且含量恒定的Ar信号峰对其它元素峰进行归一处理，W抵 消束流强度变化对信号强弱产生的影响。在相同的条件下W同样的方式测量定量标准干胶 膜的巧光谱。
[0187]图2为本发明所述的铭-低密度脂蛋白馨合物的电泳条带的同步福射X线巧光分 析图，图中横坐标为蛋白条带位置，纵坐标为该条带铭金属能量（含量）值。 阳18引 檢测条件的确定
[0189] 1.抗低密度脂蛋白抗体、抗&抗体最佳工作浓度W及血浆的最佳稀释倍数的确 定。
[0190] 酶联免疫法检测铭-低密度脂蛋白馨合物的方法，具体包括W下步骤：
[0191] 1)包被；将抗低密度脂蛋白抗体蛋白包被于固相载体上，分别用稀释缓冲液将包 被蛋白;250、1 ;500、1 ;10000、和1 ;2000的倍比稀释，加入化ISA板微孔中，每个浓度包 被S排，4°C保存18小时；
[0192] 2)封闭；移去稀释缓冲液，洗漆，加入封闭液，37°C放置1小时，移去封闭液，洗 漆；
[0193] 3)加待测样本；用稀释缓冲液将待测血浆样本按1 ;10、1 ;20、1 ;40的倍比稀释， 加至微孔中，W已知含量的铭-低密度脂蛋白馨合物作标准品，设置阴性对照和空白对照， 加至微孔中，37°C作用1小时；
[0194] 4)加抗化抗体；移去待测血浆样本，洗漆，加入用稀释缓冲液按1 ;5000、1; 10000、1 ;20000、1 ;40000的倍比稀释的抗化抗体，37°C作用1小时，使其与低密度脂蛋白 上的金属铭反应；
[0195] 5)加酶标；移去抗&抗体，洗漆，加入用稀释缓冲液稀释的HRP酶标抗体，37°C作 用1小时，使其与抗Cr抗体反应；
[0196] 6)底物温育；移去酶标抗体，洗漆，加入底物，37°C避光作用30min，加入终止液；
[0197] 7)检测；于450nm波长下在酶标仪上分别读取标准品、待测血浆、阳性对照、阴性 对照和空白对照样本的0D值，求得待测样本的含量。
[0198] 本实施例中，采用本发明提供的铭-低密度脂蛋白馨合物标准品作为阳性对照， 分别W不加待测血浆作为阴性对照1，即依次加入了抗低密度脂蛋白抗体、封闭液、抗化抗 体、酶标和底物；
[0199] W不加抗&抗体的对照试验组作为阴性对照2,即依次加入了抗低密度脂蛋白抗 体、封闭液、待测血浆、酶标和底物；
[0200] W不加酶标的对照试验组作为阴性对照3、即依次加入了抗低密度脂蛋白抗体、封 闭液、待测血浆、抗化抗体和底物；
[0201] W同时不加待测样本和抗&抗体的对照试验组作为阴性对照4,即依次加入了抗 低密度脂蛋白抗体、封闭液、酶标和底物；
[0202] W不加抗低密度脂蛋白抗体作的对照试验组为空白对照1，即加入了封闭液、待测 血浆、抗化抗体、酶标和底物；
[0203] W及W只加底物的对照试验组为空白对照2,W只加PBS的对照试验组为空白对 照3。
[0204] 表2为不同抗低密度脂蛋白抗体稀释倍比、血浆稀释倍比、抗&抗体稀释倍比的 样本0D值数据，
[0205] 表2不同抗低密度脂蛋白抗体、&抗体W及血浆稀释倍比下的检测结果
[0206]
[0207] 从表2可知，抗低密度脂蛋白抗体的稀释倍比为1:500时，样本OD值大于平行条 件下的其它抗低密度脂蛋白抗体的稀释倍比；该组样本中，血浆稀释倍比为1:10时，抗化 抗体稀释倍比为1:10000时，0D值最大，为0. 858。
[020引表3为抗低密度脂蛋白抗体的稀释倍比为1:500、血浆稀释倍比为1:10、化抗稀 释倍比为1:10000时相对应的阳性对照、阴性对照和空白对照的0D检测值，
[0209] 表3阳性对照、阴性对照及空白对照的检测结果
[0210]
[0211] 从表3可知，阴性对照组0D检测值小于0. 1，说明该优化条件下，本方法的系统误 差性小，满足分析方法要求，所W选此值所对应的浓度作为最佳工作浓度。
[0212] 2.ELISA洗脱液最佳工作浓度及洗脱时间确定
[0213] 为寻求最适宜的洗脱条件，通过酶联免疫法在抗&抗体与酶标抗体温育后，W不 同浓度的洗脱液进行洗脱，再通过酶标仪检测0D值，具体步骤如下：
[0214] (1)包被；将抗低密度脂蛋白抗体蛋白包被于固相载体上，用稀释缓冲液按1 ;500 的倍比稀释，加入化ISA板微孔中，4°C保存16