包含透明质酸的稳定组合物的制作方法
【专利说明】
[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 本申请要求2013年1月11日提交的美国临时专利申请序列号为61/751，811的 优先权，将该专利申请的全部内容并入本发明中作为参考。
技术领域
[0003]本发明通常设及包含透明质酸和/或基于透明质酸的聚合物的组合物，W及用于 制造、使用和稳定该组合物的相关方法。所得的具有生物相容性的组合物，如药物组合物， 可W用于例如生物活性剂的局部传递，W及各种医学病症的治疗。一般情况下，当与不含有 稳定量的稳定化助剂相比时，所得的组合物可W更好地保持其粘度不随时间而变化，更具 体的详情如下所述。
【背景技术】
[0004]透明质酸是一种天然存在的、阴离子型的非硫酸化粘多糖，其广泛分布于结缔组 织、上皮组织，和神经组织。平均体重为70kg(154化S)的人在他/她的体内具有约15g的 透明质酸，其中的S分之一每天被周转代谢（降解和合成）（SternR.化rJCellBiol 83(7) :317 - 25,（2004))。由于透明质酸天然存在于人体内的多个组织中，从而具有生物相 容性，因此，认为其非常适合于生物医学应用。遗憾的是，透明质酸W其天然存在的形式作 为治疗给药和使用时，通常从体内被快速清除，使得必须频繁给药。因此，非常有必要获得 既可W保持透明质酸原型所具有的如良好生物相容性的优点，又可W克服其被快速清除的 问题的透明质酸剂型。理想情况下，该剂型应该具有良好的细胞相容性，有利的化学、流变 学和其他特性，良好的稳定性，并具有方便给药的特点。
[0005] 之前已经描述了透明质酸的化学修饰形式。请参阅，例如J.W.Kuo,et al.,MaterialsofBiologicalOrigins-Materials,Analysis,andImplant Uses,ComprehensiveBiomaterials,Elsevier, 2010。透明质酸（也被称为玻尿酸），其衍 生形式、相关的组合物和共辆物，可W被用作注射生物材料，W及被用于医疗设备和植入材 料。其应用包括将治疗分子传递至局部位点，用作粘合剂或密封剂，用于组织工程中，用作 粘弹性补充剂，W及用于伤口愈合过程，等等。基于透明质酸的材料可W被制备成多种不同 的形式-粘弹性溶液，软或硬的水凝胶、无纺布编织网、海绵，等等，并且可W在临床前和临 床环境范围内使用。对于多种临床前和临床用途，保持运种基于透明质酸的材料的粘弹性 是很重要的。
[0006]因此，能够提供基于透明质酸的组合物是非常有益的，该组合物可W基本上保持 其粘弹性，例如在储存、加工和使用条件下表现出良好的化学和物理稳定性。
【发明内容】
[0007]本申请是基于，至少部分基于申请人的发现，即包含如曲安奈德（triamcinolone acentonide)或其它皮质类固醇的基于透明质酸（HA)聚合物的组合物，表现出粘度随时间 的损失明显大于不含有皮质类固醇的基于相同HA聚合物的组合物所观察到的结果。根据 上述发现，申请人已经确定某些材料可W有效地明显稳定运种含有HA聚合物的组合物，通 过引入一种或多种运种稳定化助剂使得粘度随时间基本上保持不变。因此，当与不含有稳 定化助剂的类似组合物相比时，本发明提供的组合物可W更好地保持其粘度随时间的变化 (例如，表现出减少粘度随时间的损失）。另外，本发明还提供了一种改善含有皮质类固醇 的基于透明质酸的组合物的储存稳定性的方法，该方法包括将稳定量的助剂引入该组合物 中，可W有效地导致稳定比（具体条件如下所述）大于1，优选为大于1.2,更有选为大于 1.3,其中，所述稳定比是含有稳定化助剂的主体组合物相对于不含有稳定化助剂的相同组 合物的粘度随时间损失的减少的测量值。（稳定比大于1表示在规定的时间点和特定的储 存条件下粘度保留百分数相比不含有助剂的对照组合物的改善）。
[0008] 该组合物、方法、用途等的其它实施方式通过W下描述、实施例和权利要求体现。 通过上述和下述内容可W理解的是本发明所述的每一个特征，W及两个或多个特征的每一 种组合均被包含在本发明的范围内，本发明提供的包含运种组合形式的特征是不相互矛盾 的。另外，本发明的任何实施方式均未特定包含任何特征或特征的组合。本发明的其它特 征及优点将在下述内容中予W说明，特别考虑到将具体实施例和附图结合。
[0009] 附图的简要说明
[0010] 本申请无附图。
【具体实施方式】
[0011] 下文将对本发明进行更全面地描述。然而，本发明可能通过多种不同的方式进行 实施，而不应该被理解为仅限于本发明所述的实施方式；更确切地说，提供运些实施方式 使得本发明公开得彻底和完全，并且向本领域技术人员充分地传达了本发明所要保护的范 围。
[0012] 本申请引用的所有发表文献、专利和专利申请，无论上文还是下文，均W其整体的 形式并入本文，除非另有说明。例如，在并入本文的发表文献、专利或专利申请W及本发明 公开的内容中均定义了相同的术语，在本发明公开的内容中的定义表示的是对照定义。参 考发表文献、专利和专利申请中对化合物、化学物质等的特定类型的描述，与所述化合物、 化学物质等的相关部分为本文中W引用的方式所包含的文献部分。
[001 引
[0014] 必须注意的是，本说明书中使用的单数形式"一（a)"，" 一（an)"和"该（the)"包 含复数对象，除非上下文另有明确说明。因此，例如，所述"聚合物"包含单一聚合物，W及 两种或多种相同的或不同的聚合物。
[0015] 除非特别注明，本文中术语的定义均为有机合成，W及聚合物和制药科学领域中 使用的标准定义。
[0016] 在本发明的描述和权利要求中，根据如下所述的定义使用W下术语。
[0017]"生物相容聚合物"是具有降解产物的聚合物，其与活体组织相容，或者具有有益 的生物学特性。生物相容聚合物其自身可能具有生物相容性，和/或当与生物活性剂联合 使用时具有协同生物相容性。
[0018] 术语"透明质酸聚合物"指的是含有重复二糖亚单位玻尿酸的聚合物，其中，在二 糖重复亚单位的D-葡萄糖醒酸和/或D-N-乙酷葡糖胺单位的一个或多个位点该重复单位 可能被衍生化。透明质酸聚合物或基于透明质酸的聚合物是指包含透明质酸（也被称为玻 尿酸、衍生化的透明质酸、盐的形式，和透明质酸连接复合物。
[0019] 术语"透明质酸"指的是未经修饰的或非衍生化的透明质酸。
[0020] 术语"透明质酸衍生物"或"衍生化的透明质酸"或"经修饰的透明质酸"或"取代 的透明质酸"指的是经过化学修饰的透明质酸。
[0021] 术语"反应活性"指的是官能团（如存在于聚合物中）在有机合成的常规条件下容 易发生反应或者W实际速率发生反应。运与那些不能发生反应或者需要强催化剂或者在不 可行的反应条件下才可发生反应（如"无反应活性的"或"惰性"基团）的基团截然不同。
[0022] 本文中使用的"分子质量"或分子量，在水溶性聚合物如透明质酸背景下指的是通 过多角度激光散射法测定的聚合物的标称平均分子质量。分子量可W被表示为数均分子量 或者重均分子量。除非另有说明，本文中引用的所有分子量均指的是数均分子量。在缺少 分子量值的情况下，聚合物还可W通过其内在的或固有的粘度进行表征，运是一种用于测 量分子量的粘度测定法。
[0023] 术语"水凝胶"指的是含水的=维亲水性聚合物网状结构或凝胶，其中，水是连续 相，例如，含水量大于50 % (w/w)。
[0024] 所谓"凝胶化"指的是材料呈凝胶态。
[0025]"无菌"组合物为使用美国药典无菌检验确定的无活体微生物的一种组合物。请参 阅"美国药典"，第30次修订版，美国药典委员会：2008。
[0026] 可W互换使用的术语"药物"或"药物活性剂"或"生物活性剂"或"活性剂"指的是 具有生物活性并且适用于或者被用于治疗目的的任何有机或无机化合物或原料药。"药物" 的更广泛的定义包括蛋白质、激素、抗癌剂、小分子化学化合物和类似物、寡核巧酸、DNA、 RNA和基因疗法。如本发明所使用的，所述药物如皮质类固醇，化及本发明中所述的其它化 学化合物，指的是包含任何其药学可接受形式的化合物，包括异构体，例如非对映体和对映 体，盐、溶剂化物和多晶型物，特别是晶型，W及外消旋混合物和本发明所述化合物的纯异 构体，如果适用的话。
[0027]"水不溶性药物"或"水溶性差的药物"为一种水溶解度低于lOmg/mL的药物。
[0028] 如本发明提供的术语组合物（或水凝胶或聚合物）的"有效量"或"药物有效量" 或"治疗有效量"指的是非毒性但是足W使组合物发生预期反应的量，如预防、减轻或消除 受试者体内的疼痛。所需的准确量将因受试者而异，运依赖于受试者的种族、年龄和一般情 况、治疗时的病情严重程度、使用的特定药物或多种药物、该组合物的特性、给药方式等等。 任何个例的合适"有效"量均可W通过一名本领域的普通技术人员使用常规实验方法进行 确定。
[0029]"任选的"或"可选地"指的是随后所述的情况可能发生或者可能不发生，所W所述 内容包括情况发生的实例及其不发生的实例。
[0030] 关于某一特征或实体的术语"基本上"指的是就该特征或实体方面达到显著程度 或者几乎完全的程度（如达到85%或W上的程度）。
[0031] 术语"约"，特别是关于规定量，指的是包含加或减百分之五的偏差。
[0032] 附加定义也可W在下面的章节中找到。
[0033] 概沐
[0034] 本申请是基于，至少部分基于申请人发现某些助剂可W有效地稳定组合物，通常 为含有基于透明质酸的聚合物和皮质类固醇的水性组合物。如前所述，申请人认为含有基 于透明质酸的聚合物和皮质类固醇的水性组合物表现出的粘度随时间的损失明显大于含 有基于相同的HA的聚合物但无皮质类固醇的组合物所观察到的结果。基于前述内容，申请 人已经确定某些材料可W有效地显著地稳定如包含HA聚合物的组合物，例如通过引入一 种或多种该稳定化助剂可W基本上消除粘度随时间的损失。
[003引在本文中，"稳定"指的是减少含有透明质酸聚合物-皮质类固醇（HA-C0RT)的组 合物所观察到的粘度（虽然也可W使用其它测量方式）随时间损失的程度，例如，当与未引 入助剂的含有相同透明质酸聚合物-皮质类固醇的组合物相比较时。从实施例1-27可W 看出，当暴露于加速储存的稳定条件下时（例如，在延长时间间期加速溫度），与不含有所 述稳定化助剂的HA-C0RT组合物相比，含有稳定量的某些糖（单糖，二糖，多糖）、糖醇、多元 醇、W及含有多元醇的表面活性剂的HA-C0RT组合物通过它们的稳定比表现出其粘度的保 留明显提高。稳定比是在特定的时间点和规定的储存条件下测量时，含有HA-C0RT稳定化 助剂的组合物（HA-C0RT-SA)的HA粘度保留百分数与相同HA-C0RT组合物（不含有助剂） 的HA粘度保留百分数的比值。W运种方式，通过将数据标准化，可W很容易比较助剂的作 用。在制备的组合物中，仅含有透明质酸聚合物的组合物的数据表明皮质类固醇对HA的粘 度具有失稳作用，运可W通过其作用的减弱进行证明。例如，请参阅实施例1A。在材料由于 稳定化助剂的引入而有效的情况下，粘度随时间的保留百分数具有显著性。例如，特别有用 的组合物为那些于60°C下储存6天时与其初始粘度值（零时间点）相比表现出粘度的降低 不超过约50%。作为稳定化助剂的合适材料，当于60°C下储存6天时通常将表现出相应组 合物的稳定比至少为1. 2,优选地至少为1. 3。从实施例可W看出，有效的助剂在上述条件 下产生的稳定比范围为约1. 2至约2. 6或更高。（加速储存条件/保质期的选择是任意的 并且仅需为适合作为本发明所述组合物助剂的材料提供方便的评价测量方法）。根据支持 的实施例中可W看出，基于HA的组合物可W在多个溫度（40°C、45°C、55°C、60°C、80°C等）、 湿度（环境湿度和增湿环境）和储存期（数小时，如10小时、20小时、22小时、25小时、30 小时等；数天，如1天、3天、5天、6天、7天、15天、30天、45天等；数周，如1周、2周、3周、4 周、6周、8周等；数月，如1个月、2个月、4个月、5个月、6个月等，或者甚至数年（1年或W 上））条件下进行测定。根据实施例可W看出，样本储存在更极端的条件下通常可W观察到 更明显的作用，如高溫（例如请参阅实施例13,在80°C下实施（观察到的稳定比的范围为 约5至约7)，或者延长时间间期（例如请参阅实施例22,其中稳定的组合物所具有的稳定 比为7. 47)。
[0036]紀合物[00；37]基于HA的紀分
[0038] 本发明所述的组合物中使用的透明质酸聚合物可W被衍生化或者未被衍生化，并 且可W或者不可W发生交联。另外，本发明所述组合物可W包含一种W上的透明质酸，例如 经化学修饰的透明质酸（其自身可W或者不可W发生交联）、交联的透明质酸、未经修饰的 透明质酸，或者为前述的组合。更具体地，透明质酸聚合物组分可W为流体形式或者凝胶形 式或者二者的组合。在一种优选的实施方式中，透明质酸聚合物包含悬浮在未经修饰的透 明质酸水溶液中的经修饰的透明质酸凝胶。
[0039] -种示例的经修饰的透明质酸为通过将其径基与二乙締讽反应使其衍生化，然 后与交联剂如PEG-二硫醇轻微交联所得的透明质酸。在优选的实施方式中，被修饰的透 明质酸的程度为10%或更少，在该过程中通过与二乙締讽反应将其10%或更少的径基转 化为（2-(乙締基横酷基）乙氧基）基团（(2-(vin5dsulfon}d)ethoxy)g;roups)。特别 地，透明质酸所具有的径基转化为（2-(乙締基横酷基）乙氧基）基团的转化度可W选自： 1% ,2% ,3% ,4% ,5% ,6% ,7% ,8% ,9%，和10%。可选地，透明质酸具有的径基转 化度可W在任意两个上述百分率之间的范围内：例如，从1-1〇%，2-10%，3-10%，4-10%， 等等，W及提供的整数的每个组合，例如，从2-7 %，从2-6 %，从3-8 %，从3-7 %，等等。在 另一个更具体的实施方式中，透明质酸具有的径基转化为（2-(乙締基横酷基）乙氧基）基 团的转化度约为每二糖重复单位4-5%。母体聚合物的取代/修饰程度可W通过任意数量 的合适方法进行确定，例如NMR，UV，或IR分析，或元素分析。所产生的具有活性的透明质 酸通常指的是2-(乙締基横酷基）乙氧基）透明质酸W及美国专利编号7, 829, 118所述的 VS-HAo
[0040] 适用于与透明质酸聚合物反应的交联剂例如可W为VS-HA，其中包括含有两个或 多个硫醇基团的含有硫醇的交联剂。该硫醇基团将与如经乙締讽衍生化的透明质酸中的 乙締讽发生反应。例如硫醇交联剂可W包括阳G-二硫醇化S-PEG-SH)，S臂-阳G-S硫醇 (S-arm-PEG-tri-thiol,W丙S醇为核），四臂阳G-terathiol(4-a;rm阳G-tetrathiol,W 季戊四醇为核），或者八臂阳G-八硫醇（8-arm阳G-octa-thiol，径甲基丙烷为核）。 优选的交联剂为PEG-二硫醇。交联剂的分子量通常小于经修饰的透明质酸。一般情况下， 交联剂的分子量范围为约200至约20, 000道尔顿。示例性交联剂的分子量，如PEG硫醇， 或任何其它合适的交联剂，包括约3350, 3400,和5000道尔顿，或在其它范围内。例如，请参 阅本文中的实施例28-33。实施例28描述了一种示例性经乙締讽衍生化的透明质酸的制 备，其具有的经乙締讽修饰的水平约为4%。实施例29描述了通过乙締讽衍生化的透明质 酸的反应制备凝胶的过程，所述透明质酸经分子量为3400的PEG-二硫醇交联剂进行了低 水平修饰。实施例30描述了在生理盐水中的HA-VS/PEG-二硫醇凝胶浆料的制备，而实施 例31描述了在透明质酸溶液中的HA-VS/阳G-二硫醇凝胶浆料的制备。所有运些剂型提供 了适用于引入稳定化助剂的示例性透明质酸聚合物组分，例如水溶液、凝胶及其组合。
[0041] 基于透明质酸的聚合物还可W包含如PCT/US/2004/040726(W0 2005/056608)所 述的酷阱反应性基团和/或氨氧基反应性基团，本发明关于HA衍生化的相关部分W及产生 的聚合物本身W其整体形式被本文用作参考。
[0042] 可选地，所述HA可W为经硫醇衍生化的，例如为经硫醇衍生化的透明质酸。示例 性经硫醇衍生化的透明质酸聚合物包含如美国专利号7, 981，871 ;6, 884, 788 ;6, 620, 927 ; 6, 548, 081 ;6, 537, 979 ;6, 013, 679 成 502, 081 ;和 5, 356, 883 所述的部分，与本文包含的 W其整体作为参考的所述经硫醇衍生化的聚合物相关的部分。
[0043] 透明质酸聚合物的额外实施例包括经半脫氨酸衍生化的透明质酸，其中包含但 不仅限于"粘多糖药物复合物的控释"R.V.Spareretal.,Chapter6,pages107-119,in T.J.Rosemanetal.，CONTROLLEDRELEA沈DELIVERYSYSTEMS,MarcelDekker,Inc.，New 化rk(1983)中所述的那些聚合物。
[0044] 额外的优选聚合物的实施例包含经衍生化的透明质酸，其中通过控基、芳基、取代 的控基或取代的芳基将硫醇侧基连接至N-酷基脈基团。本文提供的组合物和方法中使用 的示例性聚合物包含Carbylan?-S(详情如国际专利公开号W0 2005/056608所述）。
[0045] 另外，透明质酸或经衍生化的透明质酸可W与反应连接剂共价结合和/或与具有 双官能或多官能作用的丙締酸醋、締丙基或甲基丙締酸醋化合物发生交联。用于透明质酸 修饰的代表性连接剂包括，但并不限于，聚（乙二醇）二丙締酸醋（PEGDA)、聚（乙二醇） 二甲基丙締酸醋（PEGDM)、聚（乙二醇）二丙締（PEGDAA)和聚（乙二醇）二甲基丙締酷胺 (PEGDMA)，及其衍生物。前述连接剂的PEG部分可W为低聚的或是聚合的，例如，含有2至 100或更多的亚单位。适用于聚合物如透明质酸的修饰/官能化的额外连接剂包括但不限 于葡聚糖醋、葡聚糖醋、葡聚糖丙締酸缩水甘油醋、甲基丙締酸醋官能化的透明质酸、丙締 酸醋官能化的透明质酸、甘油二甲基丙締酸醋、1,3-二甘油醇酸二丙締酸甘油醋、山梨醇醋 及其衍生物。
[0046] 透明质酸或基于透明质酸的聚合物通常具有的平均分量范围为约700至 3, 000, 000道尔顿。例如分子量范围可W从约1，000至2, 000, 000道尔顿，或者从约5, 000 至1，000, 000道尔顿。额外的合适分子量范围包括从