增强pH控制和/或降低将柱滴定到其期望的操作PH所需的缓冲液体积的能力来选择第二官能性或另外根据它们增强PH控制和/或降低将柱滴定到其期望的操作pH所需的缓冲液体积的能力可选择第二官能性。例如，已知阴离子交换剂在暴露于升高的电导率时会产生失控的暂时pH增加。当电导率降低时，它们产生失控的暂时pH降低。这些效应的幅度和持续时间随步骤之间的电导率差异、交换剂的电荷特性和缓冲能力而变化。阳离子交换剂遭受相同的问题，但失控的PH偏离的方向与阴离子交换剂发生的方向相反。因此，将第二正电性官能性与主要负电性官能性组合会减小pH偏离的幅度和持续时间。可通过实验容易地确定官能性的理想混合物。
[0117]在采用具有不同于负电性颗粒的官能性的另外颗粒且其中将那些不同颗粒与负电性颗粒混合或在负电性颗粒之前填充在柱中的某些实施方案中，可能必需从施加于仅有负电性颗粒的柱的量向下调节最初样品体积以补偿样品体积的增加，所述增加是因病毒在穿过柱的过程中扩散时而分散的结果而发生。可通过简单实验容易地确定最初样品体积的降低(如果有的话)的必要程度，其中准则是平衡缓冲液内病毒的洗脱。
[0118]在某些实施方案中，由于所述方法的有效性不依赖于在样品施加以后立即施加的缓冲液的组成，因此所述方法不同于带负电的多孔颗粒的其它应用。在许多情况下，将有利的是，在样品施加之后立即施加缓冲液组合物，意在完全洗脱与多孔颗粒结合的材料。例如，可以25mM乙酸盐(pH 4.5)使柱平衡。将含有病毒的细胞培养物上清液(含有1.0M氯化钠，pH 7.0)以占柱体积的35%的体积施加，然后施加2M氯化钠，pH8.0。基本上被纯化的病毒被洗脱在乙酸盐缓冲液中。该现象的原因是，如上所述，病毒仅仅穿过颗粒间空间移动，而追踪-缓冲液还必须穿过颗粒内孔空间移动。该方法令人注目的特征是，它支持同时洗脱污染物和清洁柱的独特能力，具有缩短过程循环、减少过程时间和材料使用的实际益处。这使得在小柱上进行多次循环比在大柱上进行单次循环具有吸引力，这进一步减少了材料的使用。
[0119]在某些实施方案中，可能有利的是，在样品之后施加平衡缓冲液或较低电导率的缓冲液，例如20mM乙酸盐(pH 4.0)，其明确目的是增强具有大于负电性多孔颗粒的平均孔径的流体动力学尺寸的酸性污染物(例如病毒)的保留，因为它们否则可在病毒的拖尾边界处洗脱，并可能以过度且非必要的程度污染它。就所述柱可包括带正电颗粒的增量来说，这也可增强带负电污染物的去除。以约50%的填充柱体积开始，可通过实验确定低电导率追踪-缓冲液的理想体积。
[0120]在某些实施方案中，所述方法支持比通常用于多孔颗粒上的色谱的流速更快的流速。这是因为，在质量运输是对流的情况下，病毒仅仅穿过颗粒间空间移动，且因此不受病毒的缓慢扩散常数影响，也不受流速或样品粘度影响。因此，所述方法可在高达lOOOcm/hr或更大的线性流速下高效地实施，相比之下，通常的多孔颗粒色谱操作在50-100cm/hr或更低下进行。然而，高于300cm/hr的流速可能需要降低的样品体积。这是因为，能够进入孔中的污染物的质量运输是扩散性的，在增加流速或样品粘度的情况下变得低效。过度的流速为污染物实现与多孔颗粒的孔的扩散平衡提供了较少的机会。实验将揭示用于任何给定的病毒和缓冲液组合物集合的理想流速。
[0121]在其中将负电性的多孔颗粒组合在带其它表面化学性质的多孔颗粒的柱中的某些实施方案中，通常将有用的是，将最大样品体积仅仅基于负电性颗粒的体积。即使那样，可能仍然需要谨慎地通过实验确定最大样品体积，因为缺少负电性表面的颗粒的存在可能具有稀释柱内的样品的效应。
[0122]在某些实施方案中，可将带除负电性以外的表面化学性质的颗粒填充在单独的柱中，所述单独的柱与负电性颗粒柱串联悬垂。在此类构型中，可适用与针对以下情形讨论的那些相同的注意事项:将其它化学颗粒与负电性颗粒混合在同一柱中。
[0123]在某些实施方案中，本文所公开的方法可用于样品制备以后的初始纯化步骤。在其它实施方案中，它可以用于中间纯化，或它可以用于最终纯化。对本领域技术人员将显而易见的是，在其中没有将所述方法用作过程中的最后一个步骤的任何情况下，它都具有借助于如下能力来促进总过程连续性的能力:它在减少污染物的同时用缓冲液交换样品的能力。
[0124]在某些实施方案中，本发明可与其它纯化方法结合实施。具体地，它可与尺寸排阻、阴离子交换、阳离子交换、疏水相互作用、优先排阻、羟磷灰石或其它形式或混合模式的色谱或生物亲和色谱以任何组合使用；还与沉淀、结晶、超速离心和水性两相分配方法结合使用。
[0125]在获得经处理的病毒以后，可丢弃柱的内容物。或者，可用高浓度的盐对柱进行清洁，然后通过重新平衡来恢复到原始条件，使得它可用于另外的循环。还可用适当的试剂(例如氢氧化钠)将所述柱消毒。
[0126]在某些实施方案中，可将本发明机械化和自动化以增加通量。在某些此类实施方案中，例如，所述方法可包括自动化的多柱系统，例如用于进行模拟的移动床色谱。
实施例
[0127]实施例1.用于实施本发明的适合色谱介质的鉴别。评估用于实施所述方法的一系列色谱介质:S Sepharose Fast Flow、P0R0S S、Nuvia S、Capto S、GigaCap S、UN0sphereS和UNOsphere Rapid S。以如下方式制备每种介质。以300cm/hr的线性流速将40mL50%楽液填充在1.6cm直径的柱中。这产生了约1cm的床高。将流动转接器(flow adaptor)小心地降低到床的表面以避免床压缩。将所述柱悬垂到也与用于样品施加的被称为的超环(superloop)悬垂的色谱仪。以200cm/hr的线性流速用25mM乙酸盐、25mM MES (pH 5.0)平衡所述柱。施加含有部分纯化的噬菌体病毒M13的占柱体积25%的样品体积(5mL)，随后施加平衡缓冲液。除了 UNOsphere S和UNOsphere Rapid S以外的所有介质均产生了不可接受的结果，呈大量未分配到空隙体积中的病毒的形式。而是，很大部分继续洗脱在样品缓冲液中。两种UNOsphere介质均使超过90%的病毒分配到空隙中。重要的是，强调通过超环来施加样品，因为明确限定的样品边界对于最好地实施方法来说是必要的。除超环以外的装置或系统可用于样品施加，但在所有情况下，都必须注意在样品边界处引起尽可能少的分散，以确保在样品进入柱中时，样品体积适当地小。
[0128]实施例2.用于维持病毒稳定性的适合条件的鉴别。在UNOsphere S上以与实施例I相同的形式进行实验，不同的是在不同的pH值平衡柱:50mM乙酸盐(pH 4.0) ；25mM乙酸盐、25mM MES (pH4.5) ；50mM MES (pH 6.0)和 50mM Hepes (pH 7.0)。pH 4.0 和 pH 4.5 下的实验揭示了样品-盐-洗脱中的第二峰，我们将该第二峰解释为受损病毒。在更高的PH值下并未观察到所述第二峰。在PH 4.0和pH 4.5下在增加NaCl的量的情况下进行另外的实验，以确定盐是否可减轻低PH值的有害效应。它并不表明4.5和更低的pH值不适于对该病毒实施所述方法。
[0129]实施例3.用于病毒纯化的条件的鉴别.利用不同浓度的NaCl在pH 5和pH 7下进行的实验显示，在所有这些条件下，病毒M13均分配到空隙体积中，但这并不表明，纯化性能相同，因为可结合所述柱的宿主细胞蛋白质和其它污染物的比例是PH和电导率的正函数。具体地说，PH和电导率越低，将与负电性表面结合的污染物物质的多样性越大，或在其它条件下，所述病毒可耐受的最低PH和盐浓度应当使大部分污染物结合。宿主蛋白质在pH 5下降低了 99.3%，但在pH 7.0 (不存在NaCl的缓冲液)下仅降低了 27%。
实施例4.通过阴离子交换色谱、之后进行本发明的对噬菌体M13的两步病毒纯化。通过添加2份50mM Hepes (pH 7.0)将大肠杆菌(E.coli)培养基的含病毒溶液稀释3倍并且以50mL/min的流速加载到8mL径向流动QA (阴离子交换)整块材料上。在加载后，用平衡缓冲液洗涤整块材料以置换未结合的蛋白质和其它污染物。用至IM NaCl的线性盐梯度洗脱所述整块材料。以约0.4M NaCl洗脱病毒。以约0.6M NaCl洗脱残余DNA。宿主细胞蛋白质ELISA揭示污染性蛋白质的约95%降低。在不改变样品的情况下，将等同于柱体积的30%的体积的洗脱物施加到20mL的UNOsphere Rapid S柱中。将所述柱预先用20mM梓檬酸盐(pH 5.0)平衡，并且在加载后用相同缓冲液追踪所述样品。在柠檬酸盐缓冲液中，病毒被洗脱在空隙级分中。污染物被随后通过所述柱的样品-盐洗脱。宿主细胞蛋白质ELISA显示来自进料的宿主细胞蛋白质的93 %降低，两个步骤内的化合物降低合计大于99 %。
[0130]实施例5.改变样品缓冲液以实现与分级分离同时的柱再生。将电导率为约15mS/cm的未纯化病毒(噬菌体M13)的样品加载到已以20mM柠檬酸盐(pH 5.0)预先平衡的UNOsphere S柱上。将氯化钠添加到另一样品中至2M的最终浓度，产生约170mS/cm的电导率。在柠檬酸盐缓冲液中，病毒被洗脱在空隙峰中，不管被施加的样品中的盐浓度如何。高电导率的样品-盐峰洗脱的酸性污染物与所述柱结合并且使得不必在运行后续循环前施加高盐缓冲液作为清洁步骤。
[0131]实施例6.改变样品缓冲液以有利于朝向实现更高纯化程度目标的病毒与污染物之间的非特异性复合体的解离。重复实施例5的方法，不同的是将无水尿素添加到3M的最终浓度，至来自OH整块材料的洗脱物中；将无水NaCl添加到3M的最终浓度；并且将EDTA从500mM EDTA母液添加到1mM的最终浓度。添加尿素以使非特异性氢键和疏水相互作用解离。添加NaCl以使非特异性静电相互作用解离。添加Η)ΤΑ以使金属离子从病毒解离。将样品施加到UNOsphere S柱上，如实施例5中所述。在不含尿素、NaCl和EDTA的20mM柠檬酸盐缓冲液(pH5.0)中，病毒被洗脱空隙中。
[0132]实施例7.分配条件的确定。将噬菌体T4施加到用50mM乙酸盐(pH 4.5)平衡的UNOsphere S柱上。样品体积为柱体积的10 %。病毒与柱结合，表明尽管病毒等电点