为约4.5，但存在被暴露的带正电的基团。利用以相同缓冲液加150mM NaCl平衡的柱重复所述实验。病毒分配到空隙体积中。这证实病毒无需被电荷排斥以分配到空隙体积中。它只需在消除其吸引的条件下施加，在这种情况下通过NaCl。它还证实病毒的pi从属于病毒表面上的电荷分布。如果电荷已随机分布于所述表面上，则其应当已在PH 4.5下分配，如同噬菌体M13那样。其结合的事实表明能够在pH 4.5下结合交换剂的正电荷簇的存在，尽管负电荷对病毒有相反影响。
[0133]实施例8.病毒在填充于柱中的多模式负电性颗粒上的空隙分配。将5mL95%的纯■菌体M13施加到20mL的Nuvia cPrime柱上。该材料被制造商描述为组合了阳离子交换与第二疏水官能性。在一个实验中，用25mM乙酸盐、25mM MES(pH 5.0)使柱平衡到5.0的pH。约40%的病毒被洗脱在柱空隙中，而剩余的被样品-盐洗脱。利用添加到平衡缓冲液中的20mM NaCl重复所述实验。约90%的病毒被洗脱在柱空隙中，其余的紧随其后。利用50mM NaCl重复所述实验。超过95%的病毒被洗脱在柱空隙中。分别在缺乏盐的情况下和在20mM NaCl存在下，在25mM MES(pH 5.5)中进行另一系列的实验。在不存在盐的情况下，病毒仅被部分地洗脱在空隙中，而在20mM NaCl中，超过98%分配到空隙体积中。在25mM MES(pH 6.0)中进行另一实验。约98%的病毒在空隙中。该系列的实验说明pH与电导率的相互作用以及它们对病毒的空隙排阻性质的作用。它进一步说明可借以鉴别适当的pH和电导率条件的研发途径。作为参考，将相同样品施加到UNOsphere Rapid S柱上。在PH 5.5下在不存在NaCl的情况下，病毒仅被洗脱在空隙中。
[0134]实施例9.多模式的带负电的多孔颗粒柱的比较。扩展实施例8的实验以包括用Capto MMC填充的柱。而Nuvia cPrime需要大于20mM的NaCl用于使病毒完全洗脱在空隙中，MMC实现了在20mM NaCl中的完全分配。在不存在NaCl的情况下，MMC仍然未能实现分配。
[0135]实施例10.带负电的填充颗粒柱的不适合性的证实。扩展实施例8和9的实验以包括用Nuvia S填充的柱。病毒作为单峰被洗脱，但仅前35%的峰在空隙体积内。其余的与样品盐峰共洗脱。这说明带负电的不同色谱介质间的不同性能，并且强调需要实验来鉴别适合的介质。
[0136]考虑到样品体积相对于柱体积的重要性，本领域技术人员将认识到以不导致样品在样品边界处失控分散的方式施加样品的重要性，所述失控分散会具有在样品可进入柱中之前不经意地增加样品体积的效应。在所有上述实施例中都借助于被称为超环的装置来施加样品，所述装置特别避免了样品边界处的分散。
[0137]本发明可与其它纯化方法组合以实现更高的纯化水平。此类其它纯化方法的示例包括但不限于常用于纯化病毒的其它方法，例如超速离心、超滤、密度梯度过滤、亲合色谱、阴离子交换色谱、阳离子交换色谱、疏水相互作用色谱、固定化金属亲和色谱和另外的混合模式的色谱方法；以及沉淀、结晶和液液萃取的方法。研发用于各种方法的适当条件并且将它们与本文的发明整合以实现特定病毒的必要纯化，在本领域技术人员的能力范围内。
[0138]本文所引用的所有参考文献均以引用方式且出于所有目的整体并入，其并入程度就如同每个单独的出版物或专利或专利申请被明确地且个别地指明出于所有目的以引用方式整体并入一样。当以引用方式并入的出版物和专利或专利申请与本说明书中所含的公开内容相冲突时，本说明书意在替代和/或优先于任何此类相冲突的内容。
[0139]用于本说明书和权利要求中的所有表示成分的量、色谱条件等的数字均应当理解为在所有情况下被术语"约"修饰。因此，除非另有相反指明，否则本说明书和所附权利要求书中陈述的数字参数为近似值，其可根据本发明试图获得的期望性能而改变。
[0140]如对本领域技术人员将显而易见的，可进行本发明的许多更改和变化，而不脱离其精神和范围。本文所述的具体实施方案仅以举例方式提供，而不意在以任何方式进行限制。本说明书和实施例意在被认为仅仅是示例性的，本发明的真正范围和精神由所附权利要求书指明。
【主权项】
1.一种纯化包含期望病毒的样品的方法，所述方法包括以下步骤:(?)提供包含带负电的多孔颗粒的填充的色谱柱，(ii)将所述填充的色谱柱平衡到使所述样品中的期望病毒待洗脱的条件，(iii)使所述样品与所述填充的色谱柱接触，使得被施加的样品体积小于或等于所述填充的色谱柱内的所述带负电的多孔颗粒的颗粒间空间，(iv)从所述填充的色谱柱洗脱病毒蛋白质，其中所述期望病毒处于更纯的状态且处于所述填充的色谱柱被平衡到的条件。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述期望病毒为脂质包膜病毒、非脂质包膜病毒、B蜜菌体、假病毒或病毒样颗粒。3.原文缺失。4.根据权利要求1所述的方法，其中所述样品可为未纯化的、处于中等纯度水平、或高度纯度的。5.根据权利要求1所述的方法，其中所述期望病毒在其被施加到所述柱之前已被浓缩。6.根据权利要求1所述的方法，其中所述期望病毒在其被施加到所述填充的色谱柱之前已通过超滤浓缩。7.根据权利要求1所述的方法，其中所述样品在其被施加到所述填充的色谱柱之前已在其中所述病毒与一个或多个带负电的表面基本上不结合的条件下预先暴露于所述一个或者多个表面。8.根据权利要求7所述的方法，其中所述一个或多个带负电的表面进一步包含第二反应性，所述第二反应性包括参与疏水相互作用、金属亲和相互作用或其组合的能力。9.根据权利要求7或8中任一项所述的方法，其中所述一个或多个带负电的表面包括膜、整块材料、一个纤维或多个纤维、或一个颗粒或多个颗粒、或其复合构造。10.根据权利要求1所述的方法，其中所述填充的色谱柱只用带负电的多孔颗粒填充并且样品体积小于所述填充的色谱柱的体积的40 %。11.根据权利要求1所述的方法，其中所述填充的色谱柱被平衡到约2到约9的范围的pH.12.根据权利要求1所述的方法，其中所述填充的色谱柱被平衡到约0.lmS/cm到约30mS/cm的范围的电导率值。13.根据权利要求1所述的方法，其中用具有在选自由以下组成的组的范围的pH的缓冲液平衡所述填充的色谱柱:⑴约4到约8、⑵约4到约7和(3)约4.5到约6.0。14.根据权利要求1所述的方法，其中所述填充的色谱柱被平衡到约0.lmS/cm到约15mS/cm的范围的电导率值。15.根据权利要求1所述的方法，其中所述填充的色谱柱被平衡到处于或接近样品施加条件的条件，以在对包含所述期望病毒的洗脱液进行的后续纯化步骤中使用。16.根据权利要求1所述的方法，其中用于使所述样品与所述填充的色谱柱接触的样品施加条件包括约2到约10的范围的pH。17.根据权利要求1所述的方法，其中用于使所述样品与所述填充的色谱柱接触的所述样品的电导率值包括非零电导率直到对应于特定盐或盐的组合的饱和溶液的电导率的范围。18.根据权利要求1所述的方法，其中平衡所述填充的色谱柱的所述步骤包括向所述填充的色谱柱施加具有约4到约9的范围的pH的平衡缓冲液。19.根据权利要求18所述的方法，其中所述平衡缓冲液的电导率值包括约0.lmS/cm到约30mS/cm的范围。20.根据权利要求1所述的方法，其中所述带负电的多孔颗粒包括阳离子交换颗粒。21.根据权利要求1所述的方法，其中通过选自由羧基、磺基或磷酰基部分组成的组的部分将电负性部分地赋予所述带负电的多孔颗粒。22.根据权利要求1所述的方法，其中所述填充的色谱柱除包含所述带负电的多孔颗粒外还包含其它颗粒。23.根据权利要求1或22所述的方法，其中所述带负电的多孔颗粒、所述其它颗粒中的至少一种或两种具有一种或多种选自由以下组成的组的第二化学官能性:阴离子交换、疏水相互作用、氢键合、31-31相互作用和金属螯合。24.根据权利要求1所述的方法，其进一步包括在使所述样品与所述填充的色谱柱接触的所述步骤之前，使所述样品与一种或多种污染物解离剂接触的另外步骤。25.根据权利要求24所述的方法，其中在使所述样品与所述柱接触的所述步骤之前，所述污染物解离剂选自由盐、非离子型有机聚合物、有机溶剂、表面活性剂和离液剂组成的组。26.根据权利要求24或25中任一项所述的方法，其中所述污染物解离剂为选自由聚乙二醇、聚丙二醇和聚丁二醇组成的组的非离子型有机聚合物。27.根据权利要求26所述的方法，其中所述非离子型有机聚合物具有约130D到约1000D的范围的平均分子量。28.根据权利要求24-27中任一项所述的方法，其中所述污染物解离剂为选自由以下组成的组的有机溶剂:乙二醇、丙二醇、丁二醇、二甲亚砜、乙醇和苯氧乙醇。29.根据权利要求24-28中任一项所述的方法，其中所述污染物解离剂以约0.01重量/体积％到约25重量/体积％的范围的浓度提供。30.根据权利要求24-29中任一项所述的方法，其中所述污染物解离剂为选自由以下组成的组的表面活性剂:吐温、triton、CHAPS、CHAPSO和辛基葡糖苷。31.根据权利要求30所述的方法，其中所述表面活性剂以约0.001重量/体积％到约I重量/体积％的范围的浓度提供。32.根据权利要求30或31中任一项所述的方法，其中所述表面活性剂以约0.001重量/体积％到约0.1重量/体积％的范围的浓度提供。33.一种为方便实施根据权利要求1-32中任一项所述的方法而提供的试剂盒。
【专利摘要】本发明涉及一种纯化包含期望病毒的样品的方法，所述方法包括以下步骤：(i)提供填充的色谱柱，其具有带负电的多孔颗粒，(ii)将所述柱平衡到所述样品中所述期望病毒待被洗脱的条件，(iii)使所述样品与所述填充的色谱柱接触，使得被施加到所述填充的色谱柱的样品体积小于或等于所述填充的色谱柱内的所述带负电的多孔颗粒的颗粒间空间，(iv)从所述填充的色谱柱洗脱所述期望病毒，其中所述期望病毒处于更纯的状态且处于所述填充的色谱柱平衡到的条件。
【IPC分类】C12N7/02
【公开号】CN105026556
【申请号】CN201380073720
【发明人】彼得·加尼翁
【申请人】新加坡科技研究局
【公开日】2015年11月4日
【申请日】2013年2月22日
【公告号】WO2014129964A2, WO2014129964A3