8] 应用已知辣椒黄脉病毒侵染引起的辣椒病样叶片组织以及已知健康的辣椒叶片 组织为材料。
[0059] 辣椒黄脉病毒RT-LAMP检测试剂盒同实施例2。
[0060] (二）实验方法
[0061] 将所提取的辣椒病叶片组织的总RNA，按1. 0X 10 1~10 8进行浓度梯度稀释后用 作模板，分别进行RT-LAMP和普通RT-PCR检测，比较二者的检测灵敏度。
[0062] (三）实验步骤
[0063] (1)检测病样品总RNA提取：称取0. lg待检的辣椒叶片至研钵中，在液氮下研 成极细粉末，将粉末迅速转移至预冷的1.5mL离心管中，加1 mL Trizol后于室温下静置 l〇min，使其充分裂解；12 000r/min，4°C离心5min，弃沉淀，加200 yL氯仿，振荡混匀后于 室温放置15min ;12 000r/min，4°C离心15min，吸取上层水相移至另一离心管中，加0. 5mL 异丙醇，混勾后于室温放置15min ;12 000r/min，4°C离心15min，弃上清，RNA沉于管底；加 1 mL体积分数为75 %的乙醇溶液，温和振荡离心管，悬浮沉淀；8000r/min，4°C离心5min， 弃上清，室温晾干或真空干燥5~10min，最后用40 y L RNase-free ddH20溶解RNA样品， 于-80°C保存，即为待检模板RNA。
[0064] (2)RT-LAMP反应体系（25 y L) :2X反应缓冲液（荣研生物科技（中国）有限 公司）12.5yL，酶溶液（荣研生物科技（中国）有限公司）1.〇1^，4(^111 〇1/1^引物？1? 1. 0 y L，40pmol/ y L 弓| 物 BIP 1. 0 y L，lOpmol/ y L 弓| 物 F3 0? 5 y L，lOpmol/ y L 引物 B3 〇? 5 y L，荧光目视检测试剂（荣研生物科技（中国）有限公司）1. 0 y L，RNA模板1. 0 y L， 及去尚子水6. 5 y L。
[0065] RT-LAMP扩增反应的条件为：在65 °C恒温条件下，扩增反应60min后，加热至 80°C，反应5min使酶失活。
[0066] (3)结果判定
[0067] 肉眼观察：反应结束后，反应液显绿色，则判断为阳性反应；若显橙色，则判断为 阴性反应。
[0068] 电泳检测：反应结束后，取2 yL扩增产物在质量分数为1.5 %的琼脂糖凝胶上 100~125V恒压电泳30min。
[0069] (4) RT-PCR检测：采用对应量的RNA模板，根据GenBank中已登录的辣椒黄脉病毒 基因序列（GenBank序列登录号：AB594828. 1)设计扩增大小为562bp目的片段的特异引物 对P-F(5' -GTAGITCAAAITCAAGGATCCG-3' ）和 P-R(5' -GCTGAGATCTTAAGGTAGACTAG-3' ），进 行RT-PCR反应。
[0070] RT-PCR反应扩增体系参照TAKARA公司的一步法RT-PCR试剂盒说明进行配置，反 应条件为：50°C反转录30min ;94°C预变性4min，94°C变性30min、52°C退火30sec、72°C延 伸lmin，35个循环，72°C最终延伸lOmin，取8 y L扩增产物在质量分数为1. 5%的琼脂糖凝 胶上100~125V恒压电泳30min，在紫外检测仪下观察并记录结果。
[0071](四）实验结果与分析
[0072] 将感染辣椒黄脉病毒的辣椒病叶片组织总RNA进行10倍系列稀释后用作模板，分 别进行RT-LAMP反应和普通RT-PCR反应。对于RT-LAMP方法，在模板稀释倍数为10 4时，反 应液呈明显绿色（阳性反应），电泳时扩增的目的条带清晰；当模板稀释倍数为10 5时，反 应液也呈现绿色，电泳时仍可见扩增的条带；但模板稀释倍数为10 6时，反应液呈现橙色， 电泳无目的条带（阴性反应）（图3,4)。对于普通的RT-PCR方法，在模板稀释倍数为10 4 时，扩增的目的条带已经非常弱；当模板稀释倍数为10 5时，RT-PCR已经检测不到病毒（图 5)。因此，本发明的RT-LAMP检测方法比普通RT-PCR检测方法灵敏度高10倍。
[0073] 实施例4对未知辣椒病样品的检测与鉴定
[0074] ( -）实验材料
[0075] 从广东省各辣椒产区采集疑似辣椒黄脉病毒侵染引起的辣椒病样以及已知健康 的辣椒样为材料。
[0076] 辣椒黄脉病毒RT-LAMP检测试剂盒同实施例2。
[0077] (二）实验方法
[0078] 将所提取的疑似辣椒黄脉病毒引起的辣椒叶片组织的总RNA作模板，进行 RT-LAMP检测与鉴定。
[0079] (三）实验步骤
[0080] (1)检测病样品总RNA提取：称取0. lg待检的辣椒叶片至研钵中，在液氮下研 成极细粉末，将粉末迅速转移至预冷的1.5mL离心管中，加1 mL Trizol后于室温下静置 lOmin，使其充分裂解；12 000r/min，4°C离心5min，弃沉淀，加200 yL氯仿，振荡混匀后于 室温放置15min ;12 000r/min，4°C离心15min，吸取上层水相移至另一离心管中，加0. 5mL 异丙醇，混勾后于室温放置15min ;12 000r/min，4°C离心15min，弃上清，RNA沉于管底；加 1 mL体积分数为75 %的乙醇溶液，温和振荡离心管，悬浮沉淀；8000r/min，4°C离心5min， 弃上清，室温晾干或真空干燥5~lOmin，最后用40 y LRNase-freeddH20溶解RNA样品， 于-80°C保存，即为待检模板RNA。
[0081] (2)RT-LAMP反应体系（25 y L) :2X反应缓冲液（荣研生物科技（中国）有限 公司）12.5yL，酶溶液（荣研生物科技（中国）有限公司）1.〇1^，4(^111 〇1/1^引物？1? 1.0 yL，40pmol/ yL 弓| 物 BIP 1.0 yL，lOpmol/ yL 弓| 物 F30?5yL，lOpmol/ yL 引物 B3 〇? 5 y L，荧光目视检测试剂（荣研生物科技（中国）有限公司）1. 0 y L，RNA模板1. 0 y L， 及去尚子水6. 5 y L。
[0082] RT-LAMP扩增反应的条件为：在65 °C恒温条件下，扩增反应60min后，加热至 80°C，反应5min使酶失活。
[0083] (3)结果判定
[0084] 肉眼观察：反应结束后，若反应液显绿色，则判定为阳性反应；若显橙色，则判定 为阴性反应。
[0085] (4) RT-PCR验证：采用对应量的RNA模板，根据GenBank中已登录的辣椒黄脉病毒 基因序列（GenBank序列登录号：AB594828. 1)设计扩增大小为562bp目的片段的特异引物 对P-F(5' -GTAGITCAAAITCAAGGATCCG-3' ）和 P-R(5' -GCTGAGATCTTAAGGTAGACTAG-3' ），进 行RT-PCR反应。
[0086] RT-PCR反应扩增体系参照TAKARA公司的一步法RT-PCR试剂盒说明进行配置，反 应条件为：50°C反转录30min ;94°C预变性4min，94°C变性30min、52°C退火30sec、72°C延 伸lmin，35个循环，72°C最终延伸10min，取8 y L扩增产物在质量分数为1. 5%的琼脂糖凝 胶上100~125V恒压电泳30min，在紫外检测仪下观察并记录结果。
[0087](四）实验结果与分析
[0088] 采用RT-LAMP方法，对来自广东各地的7份疑似病样进行检测，结果显示（图6)， 疑似病样品1号、2号、3号、5号为阳性，4号和6号为阴性。进一步应用普通RT-PCR加以 验证，其检测结果（图7)与RT-LAMP结果一致，二者的符合率为100%。
[0089] 上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的 限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化， 均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种检测辣椒黄脉病毒的RT-LAMP引物，其特征在于包括一对外侧引物F3和B3以 及一对内侧引物FIP和BIP，其核苷酸序列如下所示： F3:GATCACGTAACACCCGCC ； B3:GCTCTCTGATAGAGACGGCC ； FIP:GCCTCCATTTCGTCGTCTTCGA-GTTCGCCCTGTCGTTGTG ； BIP:TTGGAGGAAGGTCGAGCAACAG-AAGGTGACAGATCCTGAGGA〇2. -种辣椒黄脉病毒RT-LAMP检测试剂盒，其特征在于包含权利要求1所述的 RT-LAMP 引物。3. 根据权利要求2所述的辣椒黄脉病毒RT-LAMP检测试剂盒，其特征在于： 所述的辣椒黄脉病毒RT-LAMP检测试剂盒，包含如下组分：权利要求1所述的RT-LAMP 引物；RT-LAMP反应液；酶溶液；核酸荧光染料。4. 根据权利要求3所述的辣椒黄脉病毒RT-LAMP检测试剂盒，其特征在于： 所述的 RT-LAMP 反应液包含如下组分：Tris-HCl 40mM ;KC1 20mM ;MgS0416mM ; (NH4)2S0420mM ;Tween200. 2% w/w ;Betaine I. 6M ;dNTPs 每种 2. 8mM〇5. 根据权利要求3所述的辣椒黄脉病毒RT-LAMP检测试剂盒，其特征在于： 所述的酶溶液为Bst DNA聚合酶和AMV逆转录酶的混合溶液。6. 根据权利要求3所述的辣椒黄脉病毒RT-LAMP检测试剂盒，其特征在于： 所述的核酸荧光染料为荧光目视检测试剂。7. -种检测辣椒黄脉病毒的方法，其特征在于包含如下步骤： 以待测样品的RNA为模板，利用权利要求1所述的RT-LAMP引物或权利要求2~6任一 项所述的RT-LAMP检测试剂盒进行RT-LAMP扩增反应；反应结束后观察RT-LAMP扩增反应 溶液颜色变化，若反应液显绿色，则判断为阳性反应；若反应液显橙色，则判断为阴性反应。8. 根据权利要求7所述的检测辣椒黄脉病毒的方法，其特征在于： 所述的RT-LAMP扩增反应的反应体系为25 y L反应体系，包含如下组分：RT-LAMP反应 液 12. 5 y L，酶溶液 I. 0 y L，40pmol/ y L 引物 FIP I. 0 y L，40pmol/ y L 引物 BIP I. 0 y L， IOpmol/ y L 引物 F30. 5 y L，IOpmol/ y L 引物 B30. 5 y L，核酸荧光染料 L 0 y L，RNA 模板 I. 0 y L，及去离子水6. 5 y L。9. 根据权利要求7所述的检测辣椒黄脉病毒的方法，其特征在于： 所述的RT-LAMP扩增反应的条件为：在65°C恒温条件下，扩增反应60min后，加热至 80°C，反应 5min。10. 权利要求1所述的检测辣椒黄脉病毒的RT-LAMP引物或权利要求2~6任一项所 述的辣椒黄脉病毒RT-LAMP检测试剂盒在植物病毒检测领域中的应用。
【专利摘要】本发明属于植物病毒检测领域，具体涉及一种检测辣椒黄脉病毒的RT-LAMP引物及试剂盒。本发明依据辣椒黄脉病毒CP基因序列设计一种检测辣椒黄脉病毒的RT-LAMP引物，包括外侧引物对F3和B3、内侧引物对FIP和BIP；辣椒黄脉病毒RT-LAMP检测试剂盒包含如下组分：RT-LAMP引物；RT-LAMP反应液；酶溶液；核酸荧光染料。其检测方法是以待测样品总RNA为模板，应用RT-LAMP引物或RT-LAMP检测试剂盒在65℃下进行RT-LAMP扩增反应60min，扩增后80℃再反应5min，进而鉴定待测样品是否感染辣椒黄脉病毒。本发明操作简单、快速准确、特异性强、不需要专用仪器设备等特点。
【IPC分类】C12N15/11, C12Q1/68, C12Q1/70
【公开号】CN105039600
【申请号】CN201510526746
【发明人】汤亚飞, 何自福, 佘小漫, 蓝国兵
【申请人】广东省农业科学院植物保护研究所
【公开日】2015年11月11日
【申请日】2015年8月25日