n;94°C变性 30S，58°C退火 30S，72°C延伸 30S，30 个循环；72°C延伸 7min。
[0056] 步骤（4).扩增产物电泳检测
[0057] 反应结束后，取3y1扩增产物与IyI6XLoadingBuffer混合，1 %琼脂糖凝胶 电泳检测，凝胶成像系统中观察，无任何条带，表明该猪肝样品中不存在弓形虫污染（如图 1所示）。
[0058] 实施例4
[0059] 菜市场羊肉的弓形虫检测以及毒力鉴定：
[0060] 步骤（1).样品前处理
[0061] 采集可疑羊肉25g，加入225mL灭菌的蒸馏水中，用组织勾衆机均质lmin。
[0062] 步骤（2) ?样品DNA提取
[0063] 15mL离心管中加入约50mg组织匀浆样品，加200yITE溶（pH8. 0)，涡旋混匀； 加入400y1裂解液，混匀后加600y1酚：氯仿：异戊醇（25 :24 :1)混合溶剂，剧烈振荡， 12000g离心IOmin;取上清液。加入等体积的氯仿：异戊醇（24 :1)混合溶剂，剧烈振荡， 12000g离心IOmin;取上清液，加入等体积氯仿，剧烈振荡，12000g离心IOmin;取上清液， 加0. 8倍体积异丙醇，12000g离心IOmin;取沉淀，用70%乙醇清洗1次，在室温或50°C下， 20min晾干；加80yITE(pH8. 0)溶解。将DNA提取物采用核酸蛋白检测仪测定模板DNA的 浓度与纯度。
[0064] 步骤（3) ?PCR扩增
[0065] 将PCR扩增反应体系振荡混匀后，进行PCR扩增。PCR反应体系25yI:10XPCR Buffer2. 5y1，TaqDNA聚合酶（2. 5U/y1)0. 25y1，dNTPs(2. 5mmol/L)2. 0y1，加人引物 2y1，模板DNA2. 0y1，灭菌蒸馏水补足25y1。PCR反应程序：94°C预变性4min;94°C变性 30S，58°C退火 30S，72°C延伸 30S，30 个循环；72°C延伸 7min。
[0066] 步骤（4).扩增产物电泳检测
[0067] 反应结束后，取3y1扩增产物与IyI6XLoadingBuffer混合，1 %琼脂糖凝胶 电泳检测，凝胶成像系统中观察，无任何条带出现，表明该羊肉样品无弓形虫污染（如图1 所示）。
[0068] 实施例5
[0069] 菜市场猪肉肉糜的弓形虫检测以及毒力鉴定：
[0070] 步骤（1) ?样品前处理
[0071] 采集可疑猪肉肉糜25g，加入225mL灭菌的蒸馏水中，用组织匀浆机均质lmin。
[0072] 步骤（2) ?样品DNA提取
[0073] 15mL离心管中加入约50mg组织匀浆样品，加200yITE溶（pH8. 0)，涡旋混匀； 加入400y1裂解液，混匀后加600y1酚：氯仿：异戊醇（25 :24 :1)混合溶剂，剧烈振荡， 12000g离心IOmin;取上清液。加入等体积的氯仿：异戊醇（24 :1)混合溶剂，剧烈振荡， 12000g离心IOmin;取上清液，加入等体积氯仿，剧烈振荡，12000g离心IOmin;取上清液， 加0. 8倍体积异丙醇，12000g离心IOmin;取沉淀，用70%乙醇清洗1次，在室温或50°C下， 20min晾干；加80yITE(pH8. 0)溶解。将DNA提取物采用核酸蛋白检测仪测定模板DNA的 浓度与纯度。
[0074] 步骤（3) ?PCR扩增
[0075] 将PCR扩增反应体系振荡混匀后，进行PCR扩增。PCR反应体系25yI:10XPCR Buffer2. 5y1，TaqDNA聚合酶（2. 5U/y1)0. 25y1，dNTPs(2. 5mmol/L)2. 0y1，加人引物 2y1，模板DNA2. 0y1，灭菌蒸馏水补足25y1。PCR反应程序：94°C预变性4min;94°C变性 30S，58°C退火 30S，72°C延伸 30S，30 个循环；72°C延伸 7min。
[0076] 步骤（4).扩增产物电泳检测
[0077] 反应结束后，取3y1扩增产物与IyI6XLoadingBuffer混合，1 %琼脂糖凝胶 电泳检测，凝胶成像系统中观察，在350bp左右出现一条条带，表明该猪肉肉糜存在弓形虫 污染，该虫株属于强毒力虫株（如图1所示）。
[0078] 实施例6
[0079] 菜市场香肠的弓形虫检测以及毒力鉴定：
[0080] 步骤（1).样品前处理
[0081] 采集可疑香肠25g，加入225mL灭菌的蒸馏水中，用组织勾衆机均质lmin。
[0082] 步骤（2) ?样品DNA提取
[0083] 15mL离心管中加入约50mg组织匀浆样品，加200yITE溶（pH8.0)，涡旋混匀； 加入400y1裂解液，混匀后加600y1酚：氯仿：异戊醇（25 :24 :1)混合溶剂，剧烈振荡， 12000g离心IOmin;取上清液。加入等体积的氯仿：异戊醇（24 :1)混合溶剂，剧烈振荡， 12000g离心IOmin;取上清液，加入等体积氯仿，剧烈振荡，12000g离心IOmin;取上清液， 加0.8倍体积异丙醇，12000g离心IOmin;取沉淀，用70%乙醇清洗1次，在室温或50°C下， 20min晾干；加80yITE (pH8.0)溶解。将DNA提取物采用核酸蛋白检测仪测定模板DNA的 浓度与纯度。
[0084]步骤（3) ? PCR扩增
[0085] 将PCR扩增反应体系振荡混匀后，进行PCR扩增。PCR反应体系25yI:10XPCR Buffer2. 5y1，TaqDNA聚合酶（2. 5U/y1)0. 25y1，dNTPs(2. 5mmol/L)2. 0y1，加人引物 2y1，模板DNA2. 0y1，灭菌蒸馏水补足25y1。PCR反应程序：94°C预变性4min;94°C变性 30S，58°C退火 30S，72°C延伸 30S，30 个循环；72°C延伸 7min。
[0086] 步骤（4).扩增产物电泳检测
[0087] 反应结束后，取3 y 1扩增产物与I y I 6XLoading Buffer混合，1%琼脂糖凝 胶电泳检测，凝胶成像系统中观察，在650bp左右出现一条条带，表明该香肠存在弓形虫污 染，该虫株属于弱毒力虫株（如图1所示）。
[0088] 上述实施例并非是对于本发明的限制，本发明并非仅限于上述实施例，只要符合 本发明要求，均属于本发明的保护范围。
【主权项】
1. 一种快速检测弓形虫并同时能快速鉴定该虫株毒力强弱的诊断方法，其特征在于根 据弓形虫:ropl8 ups作为特征革El基因设计出1对特异性引物FI、F2 : Fl:5' -GACTCCTCTGTCGGTCCTT-3'，如 SEQ ID NO. 1 所示； F2:5' -GCCGATTGGACTGACTG-3'，如 SEQ ID NO. 2 所示； 该方法包括以下步骤： 步骤（1).样品前处理： 将检测样品与灭菌后的蒸馏水混合，采用组织匀浆机均质，得到组织匀浆样品； 步骤（2).样品DNA提取： 取50mg步骤⑴处理后的组织匀浆样品，加入200 y I pH值为8. 0的TE缓冲溶液，涡旋 混匀；加入400 y 1裂解液，混匀后加600 y 1酚-氯仿-异戊醇混合溶剂，剧烈振荡，12000g 离心10min ;取上清液，加入与该上清液等体积的氯仿-异戊醇混合溶剂，剧烈振荡，12000g 离心10min ;取上清液，加入与该上清液等体积的氯仿，剧烈振荡，12000g离心10min ;取上 清液，加入为该上清液0. 8倍体积的异丙醇，12000g离心10min ;取沉淀，用体积含量为70 %的乙醇清洗1次，再在常温或50°C下晾干20min，然后加入80 y I pH值为8. 0的TE缓冲 溶液溶解，得到DNA提取物；将DNA提取物采用核酸蛋白检测仪测定模板DNA的浓度与纯 度； 步骤（3). PCR扩增： 将PCR扩增反应体系振荡混匀后，进行PCR扩增，得到PCR扩增产物； 所述的PCR扩增反应体系为25 y 1由10 X PCR Buffer 2. 5 y 1，浓度为2. 5U/y 1的Taq DNA 聚合酶 0? 25 y 1，浓度为 2. 5mmol/L 的 dNTPs 2. 0 y 1，加入引物 2 y 1，模板 DNA 2. 0 y 1 和余量的灭菌蒸馏水组成；其中加入引物为特异性引物F1、F2 ; 步骤（4).扩增产物电泳检测： PCR扩增反应结束后，取3 y 1扩增产物与I y I 6 X Loading Buffer混合，1 %琼脂糖 凝胶电泳检测，凝胶成像系统中观察并记录；根据出现的不同扩增片段大小判断弓形虫毒 力情况。2. 如权利要求1所述的一种快速检测弓形虫并同时能快速鉴定该虫株毒力强弱的诊 断方法，其特征在于步骤（2)所述的酚-氯仿-异戊醇混合溶剂由酚、氯仿、异戊醇按照体 积比25 :24 :1混合而成。3. 如权利要求1所述的一种快速检测弓形虫并同时能快速鉴定该虫株毒力强弱的诊 断方法，其特征在于步骤（2)所述的氯仿-异戊醇混合溶剂由氯仿、异戊醇按照体积比24: 1混合而成。4. 如权利要求1所述的一种快速检测弓形虫并同时能快速鉴定该虫株毒力强弱的诊 断方法，其特征在于步骤（2)所述的TE缓冲液为Iml浓度为1M、pH值为8. 0的Tris-Cl， 0? 2ml浓度为0? 5M、pH值为8. 0的EDTA，定容至100mL溶液。5. 如权利要求1所述的一种快速检测弓形虫并同时能快速鉴定该虫株毒力强弱的诊 断方法，其特征在于步骤（2)所述的裂解液为Tris-HCl、乙二胺四乙酸EDTA、NaCl、蛋白酶 K、十二烷基硫酸钠SDS组成的混合液，其中Tris-HCl的浓度为50mM、pH值为8. 0,乙二胺 四乙酸EDTA的浓度为25mM，NaCl的浓度为100mM，蛋白酶K的浓度为20 y g/ y L，十二烷基 硫酸钠SDS的质量分数为10 %。6. 如权利要求1所述的一种快速检测弓形虫并同时能快速鉴定该虫株毒力强弱的诊 断方法，其特征在于步骤（3)所述的加入引物为特异性引物F1、F2,引物的浓度均为25 yM。7. 如权利要求1所述的一种快速检测弓形虫并同时能快速鉴定该虫株毒力强弱的诊 断方法，其特征在于步骤（3)所述的PCR反应程序：94°C预变性4min ;94°C变性30S，58°C退 火30S，72°C延伸30S，30个循环；72°C延伸7min。8. 如权利要求1所述的一种快速检测弓形虫并同时能快速鉴定该虫株毒力强弱的诊 断方法，其特征在于步骤（4)凝胶电泳后，在350bp左右出现条带表明，该样品存在弓形虫， 而且该虫株属于强毒力虫株；如果在650bp左右出现条带，表明该样品存在弓形虫，而且该 虫株属于弱毒力虫株；如果无条带出现，则表明该样品无弓形虫污染。
【专利摘要】本发明公开一种快速检测弓形虫并鉴定毒力强弱的诊断方法。该方法是根据弓形虫rop18ups作为特征靶基因设计出1对特异性引物F1、F2。扩增后不同毒力虫株DNA片段长度大小各异，可通过电泳进行分开辨别。本发明还进行了反应的特异性验证和灵敏度检验，证明了引物设计的种间特异性和种内保守性，确保该反应能特异性检测出目标病原体并同时能鉴定出弓形虫毒力强弱，而避免假阳性的出现；同时确认了该方法的最低检测限是可以检测出1个弓形虫速殖子。
【IPC分类】C12Q1/68
【公开号】CN105087785
【申请号】CN201510451143
【发明人】曲道峰, 韩剑众, 贾凯丽, 麻琳
【申请人】浙江工商大学
【公开日】2015年11月25日
【申请日】2015年7月28日