一种快速检测弓形虫并鉴定毒力强弱的诊断方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，涉及一种快速检测弓形虫（Toxoplasmagondii)并同 时能快速鉴定该虫株毒力强弱的方法。
【背景技术】
[0002] 弓形虫是呈世界分布的能够引起人兽共患弓形虫病的专性细胞内寄生原虫，全世 界有25 %~50 %受感染，中国阳性感染率为5 %~20 %，部分地区高达30 %以上。猪爆 发弓形虫病时，可使整个猪场发病，死亡率高达60%以上，造成巨大的经济损失。弓形虫的 检测主要依靠血清学、分子生物学、病原形态鉴定等传统方法，传统的检测方法如病原学诊 断、免疫学检测等费时且不够稳定，而以核酸扩增技术为基础的分子生物学技术的迅速发 展，为快速、灵敏、特异及稳定地诊断弓形虫病提供了理论基础。
[0003] 弓形虫按照毒力强弱可以分为强毒株和弱毒株，不同地区或同一地区不同宿主的 弓形虫毒力不同，毒力不同的弓形虫虫株的致病性存在很大差异。据报道，强毒株弓形虫对 小鼠的致死剂量为1，即1个速殖子即可致死1只小鼠，而弱毒株弓形虫对小鼠的致死剂量 超过1000。目前推测，弓形虫毒力的差异与虫株之间基因组差异有关。Ropis是丝氨酸-苏 氨酸激酶，具有激酶的活性，是弓形虫重要的毒力因子。通过生物信息学软件比对，发现弓 形虫强、弱毒力虫株ropl8上游基因序列有差异，通过不同虫株基因组差异可以快速检测 弓形虫并同时鉴定该虫株毒力的强弱。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于提供一种用于快速检测弓形虫并同时能快速鉴定该虫株毒力 强弱的方法。
[0005] 本发明根据弓形虫roplSups作为特征靶基因设计出1对特异性引物F1、F2,见表 1〇
[0006] 表1、特异性引物序列
[0007]
[0008] 本发明提供了一种快速检测弓形虫（Toxoplasmagondii)并同时能快速鉴定该虫 株毒力强弱的诊断方法。
[0009] 该方法包括以下步骤：
[0010] 步骤（1).样品前处理
[0011] 取样（猪肉等）25g，加入225mL灭菌的蒸馏水，用组织匀浆机均质lmin，得到组织 匀浆样品。
[0012] 步骤（2) ?样品DNA提取
[0013] 取50mg步骤⑴处理后的组织匀浆样品，加入200yIpH值为8. 0的TE缓冲溶 液，涡旋混匀；加入400y1裂解液，混匀后加600y1酚-氯仿-异戊醇混合溶剂，剧烈振 荡，12000g离心IOmin;取上清液，加入与该上清液等体积的氯仿-异戊醇混合溶剂，剧烈 振荡，12000g离心IOmin;取上清液，加入与该上清液等体积的氯仿，剧烈振荡，12000g离心 IOmin;取上清液，加入为该上清液0. 8倍体积的异丙醇，12000g离心IOmin;取沉淀，用体 积含量为70 %的乙醇清洗1次，再在常温或50°C下晾干20min，然后加入80yIpH值为 8. 0的TE缓冲溶液溶解，得到DNA提取物；该DNA提取物即为模板DNA;将DNA提取物采用 核酸蛋白检测仪测定模板DNA的浓度与纯度；
[0014] 所述的酚-氯仿-异戊醇混合溶剂由酚、氯仿、异戊醇按照体积比25 :24 :1混合而 成；
[0015] 所述的氯仿-异戊醇混合溶剂由氯仿、异戊醇按照体积比24 :1混合而成；
[0016] 所述的TE缓冲液为Iml浓度为1M、pH值为8. 0的Tris-Cl，0. 2ml浓度为0? 5M、 pH值为8. 0的EDTA，定容至100mL溶液；
[0017] 所述的裂解液为Tris-HCl、乙二胺四乙酸EDTA、NaCl、蛋白酶K、十二烷基硫酸钠 SDS组成的混合液，其中Tris-HCl的浓度为50mM、pH值为8. 0,乙二胺四乙酸EDTA的浓度 为25mM，NaCl的浓度为100mM，蛋白酶K的浓度为20yg/yL，十二烷基硫酸钠SDS的质量 分数为10 % ;
[0018]步骤（3) .PCR扩增
[0019] 将PCR扩增反应体系振荡混匀后，进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。
[0020] 所述的PCR扩增反应体系为25y1由IOXPCRBuffer2. 5y1，浓度为2. 5U/y1 的TaqDNA聚合酶0? 25y1，浓度为2. 5mmol/L的dNTPs2. 0y1，加入引物2y1，模板DNA 2. 0y1和余量的灭菌蒸馏水组成。
[0021] 所述的PCR反应程序：94°C预变性4min;94°C变性30S，58°C退火30S，72°C延伸 30S，30 个循环；72°C延伸 7min。
[0022] 所述的加入引物为特异性引物Fl、F2,引物的浓度均为25yM;
[0023] 步骤（4).扩增产物电泳检测
[0024] PCR扩增反应结束后，取3 y 1扩增产物与I y I 6 X Loading Buffer混合，1%琼 脂糖凝胶电泳检测，凝胶成像系统中观察并记录；根据出现的不同扩增片段大小判断弓形 虫毒力情况。判断标准：凝胶电泳后，在350bp左右出现条带表明，该样品存在弓形虫，而且 该虫株属于强毒力虫株；如果在650bp左右出现条带，表明该样品存在弓形虫，而且该虫株 属于弱毒力虫株；如果无条带出现，则表明该样品无弓形虫污染。
[0025] 本发明的有益效果：本发明进行了反应的特异性验证和灵敏度检验，证明了引物 设计的种间特异性和种内保守性，确保该反应能特异性检测出目标病原体并同时能鉴定出 弓形虫毒力强弱，而避免假阳性的出现；根据不同毒力弓形虫虫株的同源性设计了 1对引 物，因此可以扩增出2条目的基因，与传统方法比较，引物数量大为减少（传统方法扩增2 条目的基因需要2对引物），从而减少了假阳性的出现；同时确认了该方法可以检测出1个 弓形虫速殖子（最低检测限）。
【附图说明】
[0026] 图1为弓形虫强、弱毒株的标准PCR图谱，其中M:Marker;泳道1 :弓形虫强毒株 扩增条带；泳道2 :弓形虫弱毒株扩增条带；泳道3 :阴性对照。
【具体实施方式】
[0027] 下面结合具体实施例对本发明做进一步的分析。
[0028] 实施例1
[0029] 菜市场猪肉的弓形虫检测以及毒力鉴定：
[0030] 步骤（1).样品前处理
[0031] 采集可疑猪肉25g，加入225mL灭菌的蒸馏水中，用组织匀浆机均质lmin。
[0032] 步骤（2) ?样品DNA提取
[0033]15mL离心管中加入约50mg组织匀浆样品，加200yITE溶（pH8. 0)，涡旋混匀； 加入400y1裂解液，混匀后加600y1酚：氯仿：异戊醇（25 :24 :1)混合溶剂，剧烈振荡， 12000g离心IOmin;取上清液。加入等体积的氯仿：异戊醇（24 :1)混合溶剂，剧烈振荡， 12000g离心IOmin;取上清液，加入等体积氯仿，剧烈振荡，12000g离心IOmin;取上清液， 加0. 8倍体积异丙醇，12000g离心IOmin;取沉淀，用70%乙醇清洗1次，在室温或50°C下， 20min晾干；加80yITE(pH8. 0)溶解。将DNA提取物采用核酸蛋白检测仪测定模板DNA的 浓度与纯度。
[0034] 步骤（3) ?PCR扩增
[0035] 将PCR扩增反应体系振荡混匀后，进行PCR扩增。PCR反应体系25yI:10XPCR Buffer2. 5y1，TaqDNA聚合酶（2. 5U/y1)0. 25y1，dNTPs(2. 5mmol/L)2. 0y1，加人引物 2y1，模板DNA2. 0y1，灭菌蒸馏水补足25y1。PCR反应程序：94°C预变性4min;94°C变性 30S，58°C退火 30S，72°C延伸 30S，30 个循环；72°C延伸 7min。
[0036] 步骤（4).扩增产物电泳检测
[0037] 反应结束后，取3y1扩增产物与IyI6XLoadingBuffer混合，1 %琼脂糖凝胶 电泳检测，凝胶成像系统中观察，在350bp左右出现一条条带，表明该猪肉样品存在弓形虫 污染，该虫株属于强毒力虫株（如图1所示）。
[0038] 实施例2
[0039] 屠宰场牛肉弓形虫检测以及毒力鉴定：
[0040] 步骤（1).样品前处理
[0041] 采集可疑牛肉25g，加入225mL灭菌的蒸馏水中，用组织匀浆机均质lmin。
[0042] 步骤（2) ?样品DNA提取
[0043] 15mL离心管中加入约50mg组织匀浆样品，加200yITE溶（pH8. 0)，涡旋混匀； 加入400y1裂解液，混匀后加600y1酚：氯仿：异戊醇（25 :24 :1)混合溶剂，剧烈振荡， 12000g离心IOmin;取上清液。加入等体积的氯仿：异戊醇（24 :1)混合溶剂，剧烈振荡， 12000g离心IOmin;取上清液，加入等体积氯仿，剧烈振荡，12000g离心IOmin;取上清液， 加0. 8倍体积异丙醇，12000g离心IOmin;取沉淀，用70%乙醇清洗1次，在室温或50°C下， 20min晾干；加80yITE(pH8. 0)溶解。将DNA提取物采用核酸蛋白检测仪测定模板DNA的 浓度与纯度。
[0044] 步骤（3) ?PCR扩增
[0045] 将PCR扩增反应体系振荡混匀后，进行PCR扩增。PCR反应体系25yI:10XPCR Buffer2. 5y1，TaqDNA聚合酶（2. 5U/y1)0. 25y1，dNTPs(2. 5mmol/L)2. 0y1，加人引物 2y1，模板DNA2. 0y1，灭菌蒸馏水补足25y1。PCR反应程序：94°C预变性4min;94°C变性 30S，58°C退火 30S，72°C延伸 30S，30 个循环；72°C延伸 7min。
[0046] 步骤（4) ?扩增产物电泳检测
[0047] 反应结束后，取3y1扩增产物与IyI6XLoadingBuffer混合，1 %琼脂糖凝胶 电泳检测，凝胶成像系统中观察，在650bp左右出现一条条带，表明该牛肉样品存在弓形虫 污染，该虫株属于弱毒力虫株（如图1所示）。
[0048] 实施例3
[0049] 菜市场猪肝的弓形虫检测以及毒力鉴定：
[0050] 步骤（1).样品前处理
[0051] 采集可疑猪肝25g，加入225mL灭菌的蒸馏水中，用组织匀浆机均质lmin。
[0052] 步骤（2) ?样品DNA提取
[0053] 15mL离心管中加入约50mg组织匀浆样品，加200yITE溶（pH8. 0)，涡旋混匀； 加入400y1裂解液，混匀后加600y1酚：氯仿：异戊醇（25 :24 :1)混合溶剂，剧烈振荡， 12000g离心IOmin;取上清液。加入等体积的氯仿：异戊醇（24 :1)混合溶剂，剧烈振荡， 12000g离心IOmin;取上清液，加入等体积氯仿，剧烈振荡，12000g离心IOmin;取上清液， 加0. 8倍体积异丙醇，12000g离心IOmin;取沉淀，用70%乙醇清洗1次，在室温或50°C下， 20min晾干；加80yITE(pH8. 0)溶解。将DNA提取物采用核酸蛋白检测仪测定模板DNA的 浓度与纯度。
[0054] 步骤（3) ?PCR扩增
[0055] 将PCR扩增反应体系振荡混匀后，进行PCR扩增。PCR反应体系25yI:10XPCR Buffer2. 5y1，TaqDNA聚合酶（2. 5U/y1)0. 25y1，dNTPs(2. 5mmol/L)2. 0y1，加人引物 2y1，模板DNA2. 0y1，灭菌蒸馏水补足25y1。PCR反应程序：94°C预变性4mi