出菌丝后，挑取形态不同的菌落移至新的PDA固体培养 基中，采用平板划线法进行纯化，分离出单菌落；将纯化后的菌株接种于PDA固体斜面培养 基中，4°C保藏备用。
[0035] 内生真菌的发酵培养：将上述筛选、分离得到的内生真菌接入50mL液体培养基 (250mL三角瓶）中，150r/min摇床振荡，27°C培养7d。用双层无菌纱布在无菌条件下进行 初过滤，取出菌丝体和孢子，4°C冷冻离心（8000r，5min)后取上清液，经0. 45ym的有机微 孔滤膜过滤后用于缬草素的测定。
[0036] ?04固体培养基&/1):去皮土豆20(^，葡萄糖20(^，琼脂2(^，口116.5~7.0， 121°C灭菌 30min。
[0037]PDA液体培养基（g/L):去皮土豆 200g，葡萄糖 200g，pH6. 5-7. 0,121°C灭菌 30min〇
[0038] 2.产缬草素的内生真菌的鉴定
[0039] 形态学鉴定：从缬草根中共分离出12株不同形态型的缬草内生真菌，筛选出的一 株内生真菌（编号为XCS-6)可产缬草素，根据《真菌分类学》和《真菌鉴定手册》进行形态 学鉴定，其菌株的形态学特征与角担菌属特征极为相近，菌落形态如图1所示，孢子显微结 构如图2所示。
[0040] 分子鉴定：利用宝生物工程（大连）有限公司试剂盒（CodeNo. 9164)提取上述 内生真菌XCS-6的DNA，取上清液作为PCR扩增模板。PCR扩增条件：以94°C预变性5min; 94°(：变性0.51^11，55°(：退火0.5111111，72°(：延伸1111111，30个循环，72°(：延伸5111111，4°(：保温的条 件进行反应扩增。PCR扩增后用2.0%的琼脂糖凝胶跑电泳，记录其电泳结果，该内生真菌XCS-6经PCR后的凝胶成像结果如图3所示，在600bp附近得到扩增片段，目的条带清晰， 证明已经从内生真菌XCS-6中成功提取出基因组DNA。电泳后切胶回收目的片段进行DNA 测序，测序交由宝生物工程（大连）有限公司进行测序（测序结果参见附表中的核苷酸序 列）。将测定后的DNA序列在NCBI数据库中用BLAST进行同源性分析，运用MEGA6. 06软件 构建系统发育树（系统发育树如图4所不）。
[0041] 结合上述形态学观察的结果，确定该内生真菌XCS-6为真菌界担子菌门伞菌纲鸡 油菌目角担菌科角担菌（Ceratobasidiumsp.AG-A)，其被命名为角担菌XCS-6。
[0042] 3.缬草内生真菌的发酵液中缬草素的检测
[0043] 缬草内生真菌角担菌XCS-6的发酵液中缬草素的检测如下：
[0044] 色谱条件：
[0045] 色谱柱：phenomenex018柱（250X4. 60mmX10ym);
[0046] 流动相：乙臆-水（60 : 40);
[0047] 流速：0? 95mL/min；
[0048] 检测波长：256nm;
[0049] 柱温：25°C;
[0050] 进样量：10yL。
[0051] 对照品溶液的制备：精密取缴草素10.OOmg，用无水甲醇稀释至100mL，得到lmg/ mL的缬草素母液。取2mL缬草素母液，用无水甲醇稀释至100mL，得到20yg/mL的缬草素 标准液，保存于4°C冰箱备用。
[0052] 供试品溶液的制备：挑取已活化的角担菌XCS-6接种于含50mL/250mLPDA液体培 养基中，于28°C120r/min摇床培养7d取出，用双层无菌纱布在无菌条件下进行初过滤，取 出菌丝体和孢子，4°C冷冻离心（8000r，5min)后取上清液，经0. 45ym的有机微孔滤膜过滤 即为供试品溶液，保存于4°C冰箱备用。
[0053] HPLC检测结果：在同一色谱条件下，供试品与缬草素对照品保留时间相同，色谱 峰一致，说明角担菌XCS-6发酵液中含有缬草素，结果见图5和图6。
[0054] 4.角担菌XCS-6在制备缬草素中的应用
[0055] -种本发明的角担菌XCS-6在制备缬草素中的应用，具体包括以下步骤：利用液 体培养基对所述角担菌菌株进行发酵培养，摇床振荡，常温下培养至少一周，得到含缬草素 的发酵液。该角担菌XCS-6产缬草素工艺参数如下表1所示：
[0056] 表1 :角担菌XCS-6产缬草素工艺参数
[0057]
[0058] 本发明中培养基发酵7d后发酵液中缬草素含量达到2. 1~2. 2mg/L，发酵过程中 培养基为PDA液体培养基，廉价易得，加上水电费、人工费等成本，每发酵产lmg缬草素的平 均成本为5-6元，与现有缬草素的生产方法（例如申请号为200710175441的一种缬草提取 物及其制备方法和用途的专利文献）和（例如申请号为201110042230的黑水缬草提取物 及其制备方法和应用）相比，不需要采集缬草根茎，有利于保护缬草资源，原料成本大幅降 低，与申请号为201110208935的黑水缬草不定根培养生产缬草素的方法中采用组织培养 法产缬草素的生产周期3个月相比，本发明产缬草素的生产周期仅为7d，生产周期大幅缩 短，且对仪器设备要求不高，且适合工业化生产，应用价值较高。
[0059] 以上描述了本发明的主要特征和具体实施步骤。本发明不受上述实施例的限制， 上述说明书和实施例中描述的是本发明的操作步骤，在不脱离本发明精神和范围的前提 下，本发明还会有各种改进，这些改进都落入要求保护的范围内。本发明要求保护的范围由 所附的权利要求书及其等效物界定。
【主权项】
1. 一株角担菌菌株，其特征在于，所述角担菌（Ceratobasidium sp. AG-A)菌株命名为 角担菌XCS-6,其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No. 9817,保藏日期为2014年10月22日。2. -种如权利要求1所述角担菌菌株在制备缬草素中的应用。3. 根据权利要求2所述的应用，其特征在于，具体包括以下步骤：利用液体培养基对所 述角担菌菌株进行发酵培养，摇床振荡，常温下培养至少6天，得到含缬草素的发酵液。4. 根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述摇床振荡的转速控制在120~180r/ min，培养温度具体控制在25°C~29°C，培养时间具体为6d~8d。5. 根据权利要求3或4所述的应用，其特征在于，所述液体培养基为PDA液体培养基， 其包括以下浓度的组分：去皮土豆200g/L，葡萄糖200g/L，pH值6. 5~7. 0,121°C下灭菌 30min〇6. -种如权利要求1所述角担菌菌株在制备镇静安眠类中成药中的应用。7. 根据权利要求6所述的应用，其特征在于，先依据权利要求2~5中任一项所述的应 用制备缬草素，再利用缬草素制备镇静安眠类中成药。
【专利摘要】一株角担菌菌株，其命名为角担菌XCS-6，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC？No.9817，保藏日期为2014年10月22日。该角担菌菌株可应用于制备缬草素，具体是利用液体培养基对角担菌菌株进行发酵培养，摇床振荡，常温下培养至少6天，得到含缬草素的发酵液。将本发明的角担菌XCS-6先应用于制备缬草素后，还可再利用缬草素制备镇静安眠类中成药。CGMCC No.981720141022
【IPC分类】C12P17/06, A61K31/19, A61P25/20, C12N1/14, C12R1/645
【公开号】CN105112296
【申请号】CN201510455176
【发明人】黎继烈, 胡铁, 谭云, 方勤敏, 王卫, 贾媛, 李振梅, 谷政伟, 张梦君
【申请人】中南林业科技大学
【公开日】2015年12月2日
【申请日】2015年7月29日