同浓度DMSO 的培养基，平行6孔；空白组仅加入25 μ L含相同浓度DMSO的培养基，不含HL-60细胞或 HaCa T细胞，平行6孔。37°C下96孔板置于5% CO2培养箱中培养48小时。之后每孔加 入10 μ L的MTS溶液，继续培养2小时。平板振荡15分钟使沉淀全部溶解，于酶标仪上 测定〇· D.值（吸光度），波长490nm〇
[0055] 实验平行重复3次，按照公式"细胞存活率=100-(D含药-D空白V(D阴性对 照-D空白）X 100%"计算每一个样品浓度下的样品作用后细胞存活率。以细胞存活率为 纵坐标，样品的浓度为横坐标作图，结果如图1所示，图1显示了本发明的化合物对HL-60 细胞和HaCa T细胞增殖的抑制活性。
[0056] 图1中的A幅显示了母核化合物二吲哚甲烷（DM)、本发明化合物ZW2-UZW2-2和 ZW2-3分别作用HL-60细胞后，细胞存活率；其中，化合物ZW2-1、ZW2-2在浓度为10 μ M时就 能使1-60细胞的存活率从100%降至40%左右；母核化合物和212-3在浓度为50以1时 也能使HL-60细胞的存活率从100%降至50%左右。从B幅可以看出，本发明化合物ZW2-1 在终浓度为8 μΜ时，白血病细胞（HL-60细胞）的细胞存活率为60%，而正常细胞（HaCa T 细胞）的细胞存活率为100% ;当终浓度提高至12 y M时，白血病细胞存活率仅有30%，而 正常细胞能维持在80%以上。C幅也表明了同样的实验结论，本发明化合物ZW2-2在终浓度 为8 μΜ时，白血病细胞存活率为60%，而正常细胞存活率为100 %;当终浓度提高至12 μΜ 时，白血病细胞存活率仅有30%，而正常细胞能维持在70%左右。可见，本发明的化合物可 以显著抑制白血病细胞（HL-60)增殖的活性，而在同样浓度范围内对正常细胞（HaCa Τ)增 殖的活性影响非常弱，表明了本发明化合物在细胞水平上具有抗癌特异性。
[0057] 实验例2 :HL_60细胞内ROS水平的测定
[0058] 为检测本发明化合物对HL-60细胞内ROS水平的影响，采用DCFH-DA探针标记法 标记用本发明化合物作用HL-60细胞前、后HL-60细胞内ROS水平，流式细胞仪检测平均荧 光强度，以说明ROS水平变化。
[0059] 将生长状态良好，处于对数生长期的HL-60细胞按I X IO5个/mL的密度接种于96 孔板中，每孔2mL。37°C下96孔板置于5% CO2培养箱中培养12小时。实验组分别加入经 灭菌处理的ZW2-1溶液和ZW2-2溶液（用含0. 05% DMSO的RPMI-1640培养基配制得到）， 每孔500 μ L，使终浓度为8 μ M，平行3孔。阴性对照组加入含等量DMSO的RPMI-1640培养 基，平行3孔。分别于作用12h、24h、36h、48h后收集HL-60细胞，按照活性氧检测试剂盒 (购自南京凯基生物科技发展有限公司）说明书中操作步骤处理细胞，具体如下：
[0060] 按照1:1000的比例用无血清培养基稀释DCFH-DA，使DCFH-DA终浓度为10 μ M，得 到DCFH-DA溶液。分别收集各组细胞，lOOOr/min离心5min，弃去上清，将细胞悬浮于稀释 好的DCFH-DA溶液中，计数并稀释细胞至浓度为IX IO6个/mL。37°C下培养箱中避光培养 20min。每隔3-5min颠倒混匀，使探针与细胞充分接触。孵育结束后，用无血清细胞培养基 洗涤细胞3次，以除去未充分进入细胞内的DCFH-DA。流式细胞仪检测细胞平均荧光强度。 参数设置为：激发光488nm，发射波长为525nm，每组计数10000个细胞。
[0061 ] 以ZW2-1和ZW2-2为例，结果如图2所示，终浓度为8 μ M的本发明化合物ZW2-1组 作用不同时间后，HL-60细胞内ROS水平依次从作用12h后的75降至24h后的60、36h后的 40、在48h后达到最低值25。终浓度为8μΜ的化合物ZW2-2组也有相同的趋势，在作用12h 后，就由起始的70降至45 ;随着时间的延长，HL-60细胞内ROS水平也在不断降低，在48h 达到最低值20。本实验例结果说明本发明化合物能够有效降低白血病细胞内ROS的水平， 进而低水平的ROS进一步诱导细胞内自噬发生，使得细胞内自噬行为失控进而诱导细胞凋 亡的发生及向成熟粒细胞分化，最终起到消灭白血病细胞，抗癌的功效。
[0062] 化合物ZW2-3组在高浓度（终浓度为50 μ M)时也有相同的结果，不再赘述。
[0063] 实验例3 :HL_60细胞自噬水平的测定
[0064] 将处于对数生长期的HL-60细胞按I X IO5个/mL的密度接种于IOcm的培养皿 中，每皿10mL。37°C下培养皿置于5% CO2培养箱中培养12小时。实验组加入经灭菌处理 的ZW2-1溶液和ZW2-2溶液（用含0. 05% DMSO的RPMI-1640培养基配制），每皿2. 5mL， 使终浓度为8 μ Μ。阴性对照组加入了含等量DMSO的RPMI-1640培养基，于作用48h后分 别收集各组HL-60细胞。收集的HL-60细胞离心（转速1000r/min，离心5min)，弃去上清 并用PBS缓冲液洗涤1次，离心弃上清，得到的HL-60细胞依次用3 % (w/w)戊二醛溶液、 1% (w/w)四氧化锇（锇酸）溶液固定，用戊二醛溶液和四氧化锇（锇酸）溶液固定之间的 间隔期用〇. IM磷酸缓冲液（PB缓冲液）漂洗3次，每次15min。在室温环境下按乙醇的浓 度分梯度（50%，70%，80%，90%，100% )脱水（15min/次）（每个浓度梯度的乙醇脱水1 次）。再用临界点干燥仪干燥后包埋、修块、定位、切片，醋酸铀、硝酸铅双重染色，电镜下观 察并拍照记录。
[0065] 以ZW2-1和ZW2-2为例，图3是通过电镜观察各组细胞后先后三次拍下来的照片 (各行为针对同一细胞的照片，电镜的条件是根据观察区域放大7000-10000倍），可以看出 ZW2-1组和ZW2-2组作用HL-60细胞内后，会产生大量自噬泡（图中用白色箭头标出），核 浆比（核浆比是指细胞核和细胞浆之间的相对大小比）较阴性对照组变小，可观察到胞浆 (胞浆是指细胞浆）中肿胀的线粒体（图中用黑色箭头标出）以及自噬体中尚未完全降解 的自噬体。这表明本发明的化合物ZW2-1和ZW2-2可以诱导白血病细胞HL-60过度自噬并 破坏线粒体等细胞器。
[0066] 化合物ZW2-3组在高浓度（终浓度为50 μ M)时也有相同的结果，不再赘述。
[0067] 实验例4 :HL_60细胞凋亡的测定
[0068] 将生长状态良好，处于对数生长期的HL-60细胞按I X IO5个/mL的密度接种于96 孔板中，每孔2mL。37°C下96孔板置于5% CO2培养箱中培养12小时。实验组分别加入 经灭菌处理的ZW2-1溶液、ZW2-2溶液和ZW2-3溶液（用含0. 05% DMSO的RPMI-1640培养 基配制得到），每孔500 μ L，使终浓度为8 μ M，平行3孔。阴性对照组加入含等量DMSO的 1640完全培养基，平行3孔。分别于作用12h、24h、36h、48h后收集HL-60细胞，按照Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒（购自南京凯基生物科技发展有限公司）说明书中的操作 步骤处理HL-60细胞，具体如下：
[0069] 1000r/min离心5min,弃上清，用4°C预冷的PBS缓冲液洗涤沉淀，重复离心、洗涤 步骤后，加入500 yL的Binding Buffer悬浮细胞，避光加入5 yL Annexin V-FITC轻轻 混勾，避光染色lOmin，加入5 yL Propidium Iodide轻轻混勾，避光染色5min后用流式细 胞仪检测HL-60细胞凋亡的数量，检测在30min内进行。流式细胞仪参数设置为：激发光 488nm，发射波长为530nm，Annexin V-FITC的绿色荧光通过FITC通道（FLl)检测；PI红色 荧光通过PI通道（FL3)检测。阴性对照组细胞作为对照进行荧光补偿调节去除光谱重迭 和设定十字门位置，每组计数10000个细胞。
[0070] 以ZW2-1和ZW2-2为例，结果如图4所示，A、B、C幅中左上角的Ql区表示因操作过 程中机械损伤的细胞数量，左下角的Q3区显示了存活的细胞数量，右上角Q2区和右下角的 Q4区显