生长溫度为35-40°C，最适 生长抑为7. 5-8. 5,在营养琼脂培养基上培养2天后，呈现淡黄色半透明菌落，且菌落扁平 不凸起，圆形至无规则形态。
[0030] 16SrDM鉴定：利用细菌的16SrDM通用引物 (27F5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3' 和 1492R5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'），提取菌株 CW282的基因组DM作为模板，进行PCR扩增，并对扩增产物进行测序。菌株CW282的16S rDNA序列如沈QIDNo. 1所示。
[0031] 3、菌株的培养
[0032] 最适固体培养基为：膜蛋白腺17.0g/l，大豆腺3.0g/l，葡萄糖2. 5g/l，^C1 5.Og/l，K2HPO42. 5g/l，琼脂20.Og/L。最适液体培养基为上述配方中不含琼脂。 阳03引最适培养条件为：37°C，180r/min振荡培养4她。
[0034] 实施例2高效液相色谱法检测菌株CW282的降解特性
[0035] 降解菌株降解动态检测：将降解菌株CW282在最适固体培养基上连续活化2代，接 种于4mL液体培养基过夜培养，获得新鲜菌液。将50μL新鲜菌液分别接种于4mL0TA测 试培养基（含20. 0μg/L0TA)和AFB1测试培养基（含20. 0μg/LAFB1)，将接种后的试管 振荡培养化、1化、24h和4她，每个降解实验设置3个重复。W大肠杆菌K12(E.coliK12) 为阴性对照菌株。培养结束后混匀，800化/min离屯、lOmin后，分别收集上清液和菌体沉淀。
[0036] 降解上清液分别经过0TA免疫亲和柱与AFB1免疫亲和柱，甲醇洗脱，收集洗脱液 于玻璃进样瓶中，按照国家标准检测方法（GB/T25220-2010和GB/T18979-2003)进行 0TA和AFB1残留量的高效液相色谱巧光检测（HPLC-FLD)。离屯、后的菌体沉淀，采用色谱纯 的甲醇进行重悬混匀，剧烈震荡lOmin提取细胞吸附的残留毒素，离屯、后弃沉淀，上清液过 0. 22μm滤膜后通过HPLC-FLD进行细胞吸附的残留毒素检测。
[0037] 降解菌株酶学特征检测：将降解菌株CW282在最适固体培养基上连续活化2代，将 活化后的菌株接种于50mL液体培养基中过夜培养，获得0成。。=0.8的新鲜菌液。将菌液 混匀，分装于50血离屯、管中，lOOOOr/min离屯、15min，弃沉淀。准确量取培养上清液40血 于无菌的洁净Ξ角瓶中，分别添加髓曲霉毒素A/黄曲霉毒素B1，使其终浓度达到20μg/L。 将配制好的Ξ角瓶30°C避光静置培养，于化、1化、24h和4化取样检测OTA/AFBl的残留浓 度。每个降解实验设置3个重复，并WE.coliK12为阴性对照菌株。将取出的样本分装于 2mL离屯、管中，离屯、，弃沉淀。上清液分别经过0TA免疫亲和柱与AFB1免疫亲和柱，甲醇洗 脱，收集洗脱液于玻璃进样瓶中，分别进行0TA和AFB1残留量检测。 阳03引 HPLC检测0TA条件为：流动相：乙腊：水：乙酸（体积比96:102:4)，巧光检测 器：激发波长333皿，发射波长460皿，流速：1. 0血/min,进样量：20μ1，色谱柱：Cis色谱柱 (4.6X250mm，填料直径5μmWaters) ;HPLC检测AFB1条件为：流动相：甲醇：水（体积比 45:55)，巧光检测器：激发波长360皿，发射波长420皿，流速：0.8血/min,进样量：20μ1，色 谱柱：Cls色谱柱（4.6X250mm，填料直径5μmWaters)，0.05%舰溶液柱后衍生法。
[0039] 菌株CW282对曲霉毒素的动态降解曲线如图2所示，实验结果表明，CW282菌株处 理2地，对0ΤΑ的降解率为70. 7 %，处理4她降解率达到95.6% ;处理24h对AFB1的降解 率为86. 9 %，处理4化后降解率超过91. 3 %。
[0040] 依照降解菌株酶学特征检测结果推测，菌株CW282对0TA和AFB1的降解机理主要 为胞内酶促降解作用，胞外粗酶液处理4化对0TA(终浓度20μg/L)的降解率仅为38. 9 %; 对AFB1 (终浓度20μg/L)的降解率为36. 7%。
[0041] 实施例3菌株CW282在玉米豆巧型饲料脱毒处理中的应用
[0042] 1、实验材料
[0043] 菌种活化培养基I:膜蛋白腺17.Og/l，大豆腺3.Og/l，葡萄糖2. 5g/l，^C1 5.Og/l，K2HPO42. 5g/l，琼脂 20.Og/L。
[0044] 菌种活化培养基II:蛋白腺5.Og/l，牛肉膏30.Og/L，化Cl5.Og/L，抑7. 0-7. 2。
[0045] 上述培养基均在120°C下高压灭菌15min，实验饲料为玉米豆巧型日粮。
[0046] 2、实验方法
[0047] 向50血憐酸盐缓冲液中加入适量0TA和AFB1标准储备液，混匀后立即倾注于 lOOg已粉碎好的饲料样品中，揽拌均匀，使0TA和AFB1的终浓度分别达到40. 0μg/kg，饲 料于阴凉通风处惊干待用。在固体活化培养基I上连续活化待测菌种2代，将活化后的菌 种接种于150血液体活化培养基II培养4她，获得0的。。=1.0的新鲜菌液。取100血新鲜 菌液与lOOg制备好的复合污染饲料混合均匀，将配制好的样品在35°C条件下培养，于化、 1化、24h和4化取样，每个降解实验设置3个重复。同时，WlOOmL新鲜空白培养基与lOOg 制备好的污染毒素混合均匀混合作为阴性对照处理。处理组和空白对照组每次取样15g，立 即进行0TA和AFB1提取和分析。 W48] 毒素的提取与纯化。称取lOg培养后的样品于150mL具塞S角瓶内，加入Ig化C1 和20血甲醇-水混合液（体积比4:1)，常溫震荡提取30min，取下瓶塞经曹纹滤纸过滤于 干净的杯子中（或在3000r/min下常溫离屯、5min)，准确移取5.0血上清液并加入20血纯 水稀释混匀，经玻璃纤维滤纸过滤1-2次至滤液澄清，进行免疫亲和柱纯化操作。
[0049] 准确移取10. 0血（代表1.Og样品）上述澄清滤液，注入玻璃注射器中，调节压力 使溶液W1-2滴/秒的流速缓慢通过免疫亲和柱，直至有部分空气通过柱体，WlOmL纯水 淋洗柱子（重复一次），弃去全部流出液并使部分空气通过柱体。准确加入1. 5mL甲醇洗 脱，流速为1滴/秒，收集洗脱液于玻璃进样瓶中，进行HPLC-FLD检测。
[0050] 实验结果如图3所示，从图3可W看出，用菌株CW282处理毒素复合污染的饲料 (终浓度分别为20μg/kg)，4化对0TA降解率为53. 2%，AFB1降解率为58. 3%。
[0051] 虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在 本发明基础上，可W对之作一些修改或改进，运对本领域技术人员而言是显而易见的。因 此，在不偏离本发明精神的基础上所做的运些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
【主权项】
1. 泉水单胞菌（Silanimonassp.)CW282,其保藏编号为CCTCCNO:M2015373。2. 含有权利要求1所述泉水单胞菌CW282的菌剂。3. 由权利要求1所述泉水单胞菌CW282或权利要求2所述菌剂制备的黄曲霉毒素B1 和赫曲霉毒素A双功能生物降解剂。4. 根据权利要求3所述的生物降解剂，其特征在于，其活性成分为由所述菌剂制备的 粗酶液。5. 根据权利要求3所述的生物降解剂，其特征在于，其活性成分为菌株CW282的发酵 液、菌株CW282发酵液经离心所得上清液或菌体裂解液。6. 根据权利要求5所述的生物降解剂，其特征在于，用于制备菌株CW282发酵液的培养 基为：胰蛋白胨 17.Og/L，大豆胨 3.Og/L，葡萄糖 2. 5g/L，NaCl5. 0g/L，K2HP04 2. 5g/L，以水 配制；发酵条件为：30°C，180r/min振荡培养48h。7. 权利要求1所述泉水单胞菌CW282、权利要求2所述菌剂、权利要求3-6任一项所述 生物降解剂在黄曲霉毒素B1和赭曲霉毒素A生物降解中的应用。8. 权利要求1所述泉水单胞菌CW282、权利要求2所述菌剂、权利要求3-6任一项所述 生物降解剂在霉变食品原料或饲料脱毒处理中的应用。9. 根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述霉变食品原料或饲料中黄曲霉毒素 B1和赭曲霉毒素A的含量分别为20μg/kg及以下。10. 权利要求1所述泉水单胞菌CW282或权利要求2所述菌剂在制备黄曲霉毒素B1和 赭曲霉毒素A双功能生物降解剂中的应用。
【专利摘要】本发明提供降解黄曲霉毒素B1和赭曲霉毒素A的泉水单胞菌及其应用。具体地，本发明提供一株双功能高效降解菌(Silanimonas？sp.)CW282及其在降解低污染浓度黄曲霉毒素B1和赭曲霉毒素A中的应用。与现有的黄曲霉毒素降解菌相比，本发明的菌株CW282能够在低浓度毒素污染条件下达到极佳的降解效果。在液体发酵条件下，在含有黄曲霉毒素B1和赭曲霉毒素A终浓度20μg/L的发酵培养液中，24h菌株CW282对赭曲霉毒素A的降解率为70.7％，48h降解率达到95.6％；24h菌株CW282对黄曲霉毒素B1的降解率为86.9％，48h降解率达到91.3％。用菌株CW282处理毒素污染的饲料(终浓度20μg/kg)，48h对赭曲霉毒素A降解率为53.2％，黄曲霉毒素B1降解率为58.3％。菌株CW282在食品及饲料生物脱毒应用方面具有实质性的应用价值和重大意义。CCTCC NO:M201537320150614
【IPC分类】C12R1/01, A23L5/20, C12N1/20
【公开号】CN105255776
【申请号】CN201510761081
【发明人】周育, 王旭, 姜楠, 韦朝领
【申请人】安徽农业大学
【公开日】2016年1月20日
【申请日】2015年11月9日