g/mL)， 倒平板，将SalinisporaarenlocolaCNS-205菌株的抱子悬液涂布平板，28°C培养5d，根据 SalinisporaarenlocolaCNS-205 菌株生长状态评定SalinisporaarenlocolaCNS-205 菌株对抗生素的敏感性。
[0031] (2)、大肠杆菌与SalinisporaarenlocolaCNS-205 之间的接合转移 将整合型质粒PSET152和PIB139通过CaClz法导入供体菌PUZ8002中，借助于PUZ8002 上tra基因，上述两种质粒[^接合转移方式从pUZ8002导入到Salinisporaarenlocola CNS-205抱子中，并进行整合。
[0032] (3)、接合转移子的验证 W整合型质粒PSET152和PIB139上的阿泊拉霉素抗性基因aac(3)IV为模板，设计引 物CP1和CP2W验证阳性接合转移子。
[0033]CP1 :5, -TTTATCACCACCGACTATTTGC-3 ; CP2 :5' -TCATCTCGTTCTCCGCTCA-3'。
[0034]提取SalinisporaarenlocolaCNS-205 基因组DNA并进行PCR验证。所用的 PCR条件反应程序为 98°C1min;98°C30s，58°C30s，72°C3〇3,30个循环；72°(：延伸10 min。
[0035] (4)、质粒pSET152 和pIB139 在SalinisporaarenlocolaCNS-205 接合转移子中 的稳定性 将接合转移子接种于不含抗生素的SFMS平板上，待其抱子成熟(约15d)后，再次接种 于不含抗生素的SFMS平板上，连续转接3次后进行分离纯化，随机挑选单菌落，转接到含有 25μg/mL阿泊拉霉素的SFMS平板上，5d后根据单菌落能否生长来确定质粒PSET152和 pIB139在接合子中的遗传稳定性。
[0036] 结果表明： (1)、SalinisporaarenlocolaCNS-205菌株对抗生素的敏感性由表1可知，SalinisporaarenlocolaCNS-205菌株在含有12.5yg/mL卡那霉素和阿泊拉霉素的培 养基上不能生长，表明SalinisporaarenlocolaCNS-205菌株对卡那霉素和阿泊拉霉素非 常敏感；SalinisporaarenlocolaCNS-205菌株在含有25μg/mL氯霉素的培养基上 不能生长，表明SalinisporaarenlocolaCNS-205菌株对氯霉素比较敏感；Salinispora arenlocolaCNS-205菌株在含有硫链丝菌素100μg/mL的培养基上都能生长，说明 SalinisporaarenlocolaCNS-205对硫链丝菌素不敏感。鉴于本发明实施例中使用的接合 转移整合型质粒携带有阿泊拉霉素抗性基因aac(3)IV，因此W25μg/mL阿泊拉霉素筛 选接合转移子。
[0037] 表1、SalinisporaarenlocolaCNS-205在四种不同浓度抗生素平板上的生长情 况，其中，大量生长（++);少量生长（+);不生长（-)。
W3引 （2)、通过两亲接合转移法分别将整合型质粒PSET152和PIB139从供体菌 pUZ8002导入到SalinisporaarenlocolaCNS-205的新鲜菌丝体和抱子中，结果表明：在SalinisporaarenlocolaCNS-205菌株萌发抱子作为受体菌与含有整合型质粒pSET152 和PIB139的PUZ8002菌株进行的两亲接合转移，能够获得阿泊拉霉素的抗性菌落；而在 SalinisporaarenlocolaCNS-205菌株新鲜菌丝体作为受体菌与含有整合型质粒pSET152 和PIB139的PUZ8002菌株进行的两亲接合转移，没有得到阿泊拉霉素的抗性菌落。
[0039] (3)、为了确定接合转移过程中受体菌（SalinisporaarenlocolaCNS-205抱 子）和供体菌（pUZ8002)接种最佳比例，不同比例的pUZ8002和Salinisporaarenlocola CNS-205抱子进行混合涂布平板。结果见表2表明：当大肠杆菌与Salinisporaarenlocola CNS-205抱子的比例达到8:1时，获得的接合转移子数最多。
[0040] 表2、基于链霉菌抱子的接合转移平板统计
(4)、WCP1和CP2为引物，进行PCR扩增验证，并W出发菌株Salinisporaarenlocola CNS-205基因组DM的扩增结果作为阴性对照，整合型质粒PSET152和PIB139的扩增结 果作为阳性对照，扩增的结果如图1所示，所获得的2株接合转移子都可W扩增出预测 的882bp条带，分别回收2株接合转移子扩增条带，TA克隆后送测序，测序结果也证实 了 2株皆为阳性克隆子。图1来自PIB139和PSET152接合转移子的PCR验证，图1中， 1:1化ladder;2:整合型质粒pIB139;3:整合型质粒pSET152;4:野生型Salinispora arenlocolaCNS-205 ;5 :含有PIB139的接合转移子；6 :含有PSET152的接合转移子。1: 1 kbladder; 2:pIB139plasmid; 3:pSET152plasmid; 4:wild-type; 5:wild-type/ pIB139; 6:wild-type/p沈T152。
[0041] (5)、为了检测整合型质粒pIB139 和p沈T152 在Salinisporaarenlocola CNS-205菌株中的稳定性，随机挑取验证正确的200个接合转移子，发现它们在添加有阿泊 拉霉素和无抗生素的SFMS培养基平板上都能生长，没有发现阿泊拉霉素抗性消失的菌落。 结果表明整合型质粒PIB139和PSET152在SalinisporaarenlocolaCNS-205菌株中可稳 定存在。
[0042]由上述实施例1可知，通过对SalinisporaarenlocolaCNS-205抗生素敏感性和 基于SalinisporaarenlocolaCNS-205抱子和菌丝体接合转移系统的测定，成功地将位点 特异性整合型质粒pIB139和pSET152整合到SalinisporaarenlocolaCNS-205染色体中， 在分子水平证明所获得的接合转移子的正确性，运说明建立的海洋放线菌基因遗传操作系 统是有效可行的，为后续SalinisporaarenlocolaCNS-205染色体上各基因的功能研究和 生物合成基因的改造奠定了基础。
[0043] 综上所述，本发明提供的一种海洋放线菌基因遗传操作系统的构建方法，通过 建立SalinisporaarenlocolaCNS-205的基因转移体系，通过接合转移向Salinispora arenlocolaCNS-205 导入外源DNA片段。 W44] 应当理解的是，本发明的应用不限于上述的举例，对本领域普通技术人员来说，可 W根据上述说明加W改进或变换，所有运些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保 护范围。
【主权项】
1. 一种海洋放线菌基因遗传操作系统的构建方法，其特征在于，包括步骤： A、 将已灭菌的SFMS培养基融化，温度降至40~50°C，在SFMS培养基中加入适量的抗生 素，倒平板，将SalinisporaarenlocolaCNS-205孢子悬液涂布平板，25~30°C培养4~5d; B、 将整合型质粒通过CaCV法导入供体菌中，借助于供体菌上tra基因，所述整合型质 粒以接合转移方式从供体菌导入到步骤A得到的SalinisporaarenlocolaCNS-205孢子 中进行整合。2. 根据权利要求1所述的海洋放线菌基因遗传操作系统的构建方法，其特征在于，所 述步骤A中，所述抗生素为阿泊拉霉素。3. 根据权利要求1所述的海洋放线菌基因遗传操作系统的构建方法，其特征在于，所 述步骤B中，所述整合型质粒为pSET152和pIB139。4. 根据权利要求1所述的海洋放线菌基因遗传操作系统的构建方法，其特征在于，所 述步骤B中，所述供体菌为pUZ8002。5. 根据权利要求1所述的海洋放线菌基因遗传操作系统的构建方法，其特征在于，所 述步骤B中，供体菌与受体菌SalinisporaarenlocolaCNS-205孢子的比例为（15~1):1。6. 根据权利要求1所述的海洋放线菌基因遗传操作系统的构建方法，其特征在于，所 述步骤B中，供体菌与受体菌SalinisporaarenlocolaCNS-205孢子的比例为8:1。7. 根据权利要求1所述的海洋放线菌基因遗传操作系统的构建方法，其特征在于，所 述步骤B之后包括：以整合型质粒pSET152和pIB139上的阿泊拉霉素抗性基因aac(3)IV 为模板，设计引物CP1和CP2以验证接合转移子，提取SalinisporaarenlocolaCNS-205 基因组DNA并进行PCR验证。8. 根据权利要求7所述的海洋放线菌基因遗传操作系统的构建方法，其特征在于，所 述CP1 为 5' -TTTATCACCACCGACTATTTGC-3' ；所述CP2 为 5' -TCATCTCGTTCTCCGCTCA-3'。9. 根据权利要求7所述的海洋放线菌基因遗传操作系统的构建方法，其特征在于，所 述卩0?验证的条件反应程序为98°(：11^11;981€3〇8,581€3〇8,721€3〇8,30个循环； 72°C延伸 10min。
【专利摘要】本发明公开一种海洋放线菌基因遗传操作系统的构建方法，其包括步骤：将已灭菌的SFMS培养基融化，温度降至40~50℃，在SFMS培养基中加入适量的抗生素，倒平板，将Salinispora？arenlocola？CNS-205孢子悬液涂布平板，25~30℃培养4~5d；将整合型质粒通过CaCl2法导入接合转移供体菌中，借助于供体菌上tra基因，所述整合型质粒以接合转移方式从供体菌导入到步骤A得到的Salinispora？arenlocola？CNS-205孢子中进行整合。通过上述技术方案，实现了向Salinispora？arenlocola？CNS-205导入外源DNA片段的可能性。
【IPC分类】C12N15/76
【公开号】CN105255936
【申请号】CN201510663567
【发明人】马艳玲, 陈婉容, 刑福炜, 李锐
【申请人】佛山科学技术学院
【公开日】2016年1月20日
【申请日】2015年10月15日