一种新的基因组简化甲基化测序文库的制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及分子生物学及表观遗传学基因组DNA甲基化谱变化的技术领域，具体 设及一种新的基因组简化甲基化测序文库的制备方法。
【背景技术】
[0002] 表观遗传机制，包括DNA甲基化是高等植物和动物基因表达控制的重要决定因 素。在真核生物中，基因组DNA甲基化是一种非常重要的表观遗传学标记，它能影响染色质 的结构和基因的表达。早在1975年，化lliday和化ggs等人就已经发现在脊椎动物DNA上 的胞喀晚在CpG位点的甲基化可作为遗传学的标记，运种甲基化能通过体细胞的分裂进行 遗传。在植物和哺乳动物中胞喀晚残基第5位碳原子上的甲基化现象是研究最广泛的表观 遗传修饰。除了CG甲基化外，还有CHG和CHH的甲基化化=A、C或T)，绝大多数存在于 CG序列上。目前，已经有一些重要的模式真核生物如人类、鼠、拟南芥、水稻等基因组数据已 经公布，而且部分物种基于重亚硫酸盐测序的全基因组甲基化谱结果也已经发表，但是DNA 甲基化现象并不依赖完全序列的变异，它与环境胁迫、生物胁迫W及各世代间的基因印记 等有关，同一物种的不同组织或者同一组织不同发育时期的DNA甲基化状态并不是一成不 变的。
[0003] 此外，尚有大量生物物种的基因组是未知的，运些物种从基因组序列完全测序、组 装注释完成需要耗费大量的时间及人力财力。即使我们得到了较完整的基因组序列，但由 于真核生物在基因组甲基化与转录水平调控的复杂性，仍然要不断研究不同条件下的基因 甲基化的改变和转录本特定调控之间的联系。其关键问题就是掲示细胞在特定时空背景特 定条件下的基因甲基化状态。目前，在植物研究领域许多研究都在直接或间接的说明植物 DNA甲基化对基因表达调控过程的重要意义。研究较多的有盐胁迫、氮处理、重金属处理及 干旱胁迫、热胁迫等。早期的基因组DNA甲基化分析技术有SssI甲基转移酶分析法、氯乙 醒反应法和免疫学抗体技术等，但运些方法已经不能满足现代表观遗传学研究的需求。随 着测序技术的发展，全基因组范围内的DNA甲基化水平也得W了解。开展全基因组DNA甲 基化研究的方法，大致可分为3类：利用甲基化敏感的限制性内切酶结合聚丙締酷胺凝胶 电泳（MSAP)进行多态性检测、利用重亚硫酸盐修饰法和忍片技术。根据检测的目的可W选 择不同的分析方法。
[0004]MSAP(Methylation-sensitiveamplifiedpolymo巧hism，DNA甲基化敏感扩增多 态性）是一种敏感性好、实用性强的检测DNA甲基化的技术。该方法是在AFLP技术的基础 上发展而来的，利用对DNA甲基化敏感性不同的同工酶化pan和MspI)分别切割DNA，它们 都能识别并切割5' -CCGG序列，但该过程受识别序列的胞喀晚的甲基化程度影响。化all 对甲基化敏感，当识别序列中有1个或2个喀晚碱基被甲基化时则不能切割（2条链都甲基 化），MspI对甲基化不敏感，能切割内甲基化的5' -CCGG，但不能切割C5'CGG。EcoRI酶切 位点广泛的分别在基因组上，利用EcoRI/化pll和EcoRI/MspI两种双酶切组合分别对基因 组DNA限制消化，将产生的不同酶切产物添加接头，随后进行PCR扩增、PAGE电泳、银染，产 生可见的具有不同酶切型式的谱带，即可得知dm甲基化信息。该方法的优势在于成本较 低，数据反应直观，可W反映全基因组甲基化水平的变化趋势。但是该方法无法应对大样品 数的甲基化水平的检测，同时存在人为实验和数据读取的误差，还有流程繁琐、重复差、数 据覆盖度低等不足之处。
[0005] 重亚硫酸盐（Sodiumbisulfite)法可将DNA上未甲基化的胞喀晚C全部转化为 尿喀晚U，后续的PCR扩增可W使U与A配对转变成T，而甲基化的C则不会被重亚硫酸盐 修饰，运样DNA包含的甲基化信息就转变为具有差异的DNA序列。目前，基于重亚硫酸盐法 产生了许多甲基化检测的方法，甲基化特异位点检测包括甲基化特异性PCR法、DNA甲基化 巧光PCR检测、结合亚硫酸氨钢处理和酶解分析法（COBRA)和甲基化敏感的单核巧酸的扩 增（Ms-SnuP巧等。但是，W上运些方法只能检测特定的已知位点区域的甲基化状态，不能 进行基因组层面的检测，因此只能在部分基因研究中采用。为了进行基因组层面的DNA甲 基化水平的研究，近年来将重亚硫酸盐法与高通量测序的方法结合，发展出来了全基因组 重亚硫酸盐测序（wholegenomebisulfitesequencing,WGB巧和简化基因组甲基化测序 (reducedrepresentationbisulfitesequencing,RRB巧两种方法。WGBS方法可W检测 单碱基C的甲基化状态，其原理是先将基因组DNA利用超声波破碎仪进行打断，打断的片段 进行修复与纯化，平末端产物进行加A与连接，连接接头使用特异的甲基化了的胞喀晚C的 引物序列，然后进行重亚硫酸盐法处理，产物进行PCR富集扩增，最后将PCR文库进行上机 测序，测序深度一般为20X-30X。而RRBS法的原理是先用MspI酶对基因组进行单酶切， 酶切后的产物进行末端修复与加A连接反应，连接接头同样使用的是特异的甲基化了的胞 喀晚C的引物序列，然后进行重亚硫酸盐法处理，产物进行PCR富集扩增，最后将PCR文库 进行上机测序，测序深度一般为20X-30X。前者最大的优点是可进行全基因组单碱基分辨 率的甲基化水平的检测，后者虽对基因组进行了简化酶切，但会导致覆盖率下降，同时运两 种方法只适用于有参考基因组的物种，若进行大样本数目或者对大基因组样本的测序，测 序成本会睹然升高，同时分析成本也非常高。若前期重亚硫酸氨盐处理不充分，会直接导致 非甲基化胞喀晚C未完全转变为U，后续下机的数据无法开展分析或者分析的数据与理论 值相差甚远，另外重亚硫酸盐测序的文库碱基分布极不平衡，测序的错误率较高。
[0006] 甲基化忍片技术主要W不同的DNA预处理方法为基础，包括限制性内切酶和免疫 沉淀两种预处理方法。限制性内切酶可用于与忍片技术结合检测DNA甲基化，主要有甲基 化依赖型限制性内切酶、对甲基化敏感性不同的同工酶W及甲基化敏感性内切酶Ξ种限制 性内切酶。免疫沉淀与忍片方法的结合应用主要包括依赖5-甲基胞喀晚抗体免疫沉淀富 集甲基化片段法和甲基化结合蛋白（MBD)免疫沉淀甲基化DNA片段法两种。它们的主要原 理是设计已知的甲基化区段的检测忍片探针，利用上述的Ξ种限制性内切酶对DNA样品进 行酶切或者对破碎后的DNA样本进行免疫沉淀，将酶切或者免疫沉淀后的片段进行回收， 然后对运些回收样本进行忍片探针杂交反应，最后进行忍片成像和数据读取。结合限制性 酶的忍片方法具有较高的灵敏度，而免疫沉淀方法则特异性高，但是目前国际上仅有少数 研究小组在开展DNA甲基化忍片的研究工作，基因忍片技术的出现虽然为检测DNA甲基化 的高通量提供了技术平台，然而检测忍片的研究仍然起步较晚，检测忍片的制备较难，同时 忍片的制备尚需大量实验数据的支撑。
[0007] 目前，通过有效对基因组层面的甲基化数据的检测方法并不多，WGBS和RRBS的方 法还未大规模的应用。因此，有必要建立一种既发挥w上技术的优点也克服w上技术的不 足的新技术方法来检测基因组的甲基化的差异。
【发明内容】
[0008] 本发明的目的在于提供了一种新的基因组简化甲基化测序文库的制备 方法。本发明将运种新的基因组简化甲基化测序称为甲基化敏感多态性测序 (Methylation-sensitiveamplifiedpolymorphism-sequencing，MASP-seq)，它将MSAP的 限制性内切酶酶切原理与高通量测序方法有机地结合起来，具有高覆盖率、低冗余、高灵敏 度、大规模样品和高性价比等优点。本发明普遍适于常规分子生物学实验室进行各种基因 组甲基化差异研究，尤其是在植物、动物及人类疾病的分子生物学诊断等领域中具有潜在 而广泛的应用价值。
[0009] 为了实现上述的目的，本发明采用W下技术方案：
[0010] 上述简化甲基化测序（MSAP-seq)为：利用双酶切组合的方法，分别选取EcoRI/ MspI和EcoRI/化pll两种双酶切组合对基因组DM进行酶切，相比RRBS的单酶切而言，可 W保证较高的数据覆盖率和合适的扩增片段长度。酶切后的片段进行纯化，设计特异的接 头引物（包含条码标签化arcode)，可W极大提高检测样本数目），对上述酶切纯化后的两 种DNA片段进行连接。连接后的产物分成EcoRI/MspI酶切连接组和EcoRI/化pll连接组， 分别将两组不同样本的酶切连接组的连接产物混合