上述纯化的各酶切 样本和MspI/化all。如bit2. 0定量检测每种酶切产物的浓度，保证每个样品酶切后进行连 接的总量相同，每个样品起始量连接总量均为30化g。连接体系40μL:MspI/化an接头和 EcoRI接头终浓度1μM，T4DNA连接酶为40U，每种酶切样本DM量为30化g。
[0082] EcoRI接头序列为：
[0083] F(5' -3' ) :ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTNNN順，
[0084] R(5, -3,）：/5I%os/AATTNNNNNAGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT;
[0085] Mspl/Hpall接头序列为：
[0086] F(5' -3' ) :GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT，
[0087] R(5' -3' ） ：/5Phos/CGAGATCGGAAGAGCGAGAACAA。
[008引 其中NNNNN为barcode序列，每种酶切产物对应的barcode序列见上述表4,共有 4种。
[0089] (4)混样与片段选择。将四个酶切连接组的产物按照体积等量混合成一个池，等 量分成两份，取一份别标记为HM组，另外一份备份使用，每份80μL。混合样品通过磁珠对 歷组样品进行纯化，AMPureXP磁珠用量为1.6X即128μL。回收的样品进行2%琼脂糖 凝胶电泳（120V，化），回收300-400bp之间的胶块，最终用25μLΤΕ溶解。
[0090] 巧)PCR扩增和胶回收。将上述回收的片段，进行PCR扩增，扩增酶选用Q5化Fi热 启动酶（肥B，美国），PCR引物序列为：
[0091] F(5, -3, ） ：AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACG，
[0092] R(5，-3，）：CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATNNNNNNGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGC。
[009引PCR引物R序列中的NNNN順代表指示标签序列，只采用1种，见上述表4。
[0094]PCR扩增体系为50μ^其中ΙΟμΜ正反引物各取1μ^Q5化Fi热启动酶mix取 25μレ上述回收产物取23μL。PCR扩增程序为：98°Clmin，l个循环；98°C10s，65°C30s， 72°C30s，循环数10个；72°C5min，1个循环；4°C终止反应。
[009引扩增后的PCR产物进行2%琼脂糖凝胶电泳（120V，50min)，回收350~450之间 的片段，最终用18μΙTE溶解。回收的产物就是预混样文库，标记为歷文库，此文库包含 了新鲜叶片和成熟叶片两种酶切组合的两种文库信息。
[0096] (6)文库的质检。取1μL歷文库，利用安捷伦2100核酸分析进行毛细管电泳检 巧。。再取1μ以利用如bit2. 0核酸定量检测仪进行浓度定量检测。结果如图3,ΗΜ文库峰 值范围350~450bp之间，浓度为5. 86ng/μ以符合上机测序要求。
[0097] 上述结果表明本方法发明能够制备不同组织类型DNA或者相同组织不同发育时 期的MSAP-seq文库，文库质检后可W进行高通量上机测序。据此，它适用于同一物种的不 同组织或者同一组织在不同的发育时期和不同生理病理条件下的样本DM甲基化差异研 究。本发明具有较高灵敏度、精确度、覆盖率、高通量和重复性的特点，成本低廉，普遍适用 于不同的实验室进行多个样本的基因组甲基化差异的研究，因而本发明在同领域中具有极 高的性价比。
[0098] 上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的 限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化， 均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种新的基因组简化甲基化测序文库的制备方法，其特征在于包括以下步骤： (1) 提取同一物种不同组织或者相同组织不同发育时期的基因组DNA; (2) 分别选取EcoRI/MspI和EcoRI/Hpall两种双酶切组合对不同样品的基因组DNA进 行酶切；对酶切后的片段进行纯化； (3) 用T4DNA连接酶连接EcoRI接头、纯化的酶切片段、MspI(Hpall)接头；EcoRI接头、 MspI(Hpall)接头的序列如下： EcoR接头序列为： Fl(5' -3' ） ：ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTNNNNN， Rl(5' _3' ） ：/5Phos/AATTNNNNNAGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT; Mspl/Hpall接头序列为： F2(5' -3' ） ：GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT， R2(5' -3'）：/5Phos/CGAGATCGGAAGAGCGAGAACAA; 其中，EcoRI接头序列中的NNNNN代表条码序列，FI、R1引物中的NNNNN为互补的序列， 条码信息见表1，表1中条码序列与F1上的NNNNN五碱基序列相同，R1的NNNNN序列与条 码序列反向互补；/5Phos/代表5'端起始碱基为磷酸基团修饰； 表1.条码和指示标签信息表(4) 分别将EcoRI/MspI酶切连接组和EcoRI/Hpall酶切连接组连接产物混合成两个 池，将两个池样本进行纯化，纯化后的样本进行琼脂糖凝胶电泳，电泳完成后切胶回收片段 大小为300~400bp的DNA片段； (5) 利用含指示标签序列的PCR引物对回收的片段进行PCR富集，PCR产物通过琼脂糖 凝胶电泳回收350~450bp的片段，回收的片段即为测序文库； PCR引物序列为： F3(5' -3' ）：AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACG， R3(5' _3'）：CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATNNNNNNGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGC; 其中，PCR引物R3序列中的NNNNNN代表指示标签序列，指示标签信息见表1，表1中指 不标签序列与R3引物中的NNNNNN八喊基序列反向互补。2. 根据权利要求1所述的新的基因组简化甲基化测序文库的制备方法，其特征在于： 步骤⑵中的酶切体系为50μL，EcoRI、MspI和HapII酶量分别为20U、10U和10U;动物组 织的酶切时间为3h，植物组织的酶切时间为6h;不同样品的酶切体系中基因组DNA的起始 量相同，起始量为100~500ng之间。3. 根据权利要求1所述的新的基因组简化甲基化测序文库的制备方法，其特征在于： 步骤（3)中连接的体系为40μL，两种接头终浓度均为1μM，T4DNA连接酶终浓度为40U;不 同样品的连接体系中酶切纯化后的DNA的起始量相同，起始量为100~500ng之间。4. 根据权利要求1所述的新的基因组简化甲基化测序文库的制备方法，其特征在于： 步骤（2)和（4)中的纯化为用磁珠进行纯化。5. 根据权利要求1所述的新的基因组简化甲基化测序文库的制备方法，其特征在于： 步骤（4)和（5)中的琼脂糖凝胶电泳为2%琼脂糖凝胶电泳，电泳条件分别为120V2h和
【专利摘要】本发明公开了一种新的基因组简化甲基化测序文库的制备方法，该方法为：分别选取<i>EcoR</i>I/<i>Msp</i>I和<i>EcoR</i>I/<i>Hap</i>II两种双酶切组合对基因组DNA进行酶切，酶切后的片段进行纯化；设计特异的接头引物，对纯化后的DNA片段进行连接；连接后的产物分成两组，混合成两个池；将混合池样本进行纯化和琼脂糖凝胶电泳回收300～400bp的片段；利用所设计的特异PCR引物，对回收后的片段进行PCR富集和琼脂糖凝胶电泳回收，即得到测序文库。本发明具有高覆盖率、低冗余、高灵敏度、大规模样品、高性价比、结果可靠性高、实验可重复性好等优点，普遍适于常规分子生物学实验室进行各种基因组甲基化差异研究。
【IPC分类】C12N15/10, C40B50/06
【公开号】CN105256379
【申请号】CN201510822944
【发明人】丁毅, 张洪源
【申请人】武汉大学
【公开日】2016年1月20日
【申请日】2015年11月23日