管电泳的结果 图。A:化an组文库，文库峰值平均值为41化口，文库浓度为2. 46ng/μL。B:MspI组文库，文 库峰值平均值为4(Ubp，文库浓度为5.long/μL。横轴代表碱基数目，纵轴代表巧光强度， 中间峰为文库样品的检测峰，左、右两侧峰为参照峰，检测峰中间横线代表文库片段范围。
[0043]图3是实施例2所制备的歷文库利用安捷伦2100核酸分析仪进行毛细管电泳的 结果图。文库峰值平均值为39化Ρ，文库浓度为5. 86ng/yL。横轴代表碱基数目，纵轴代表 巧光强度，中间峰为文库样品的检测峰，左、右两侧峰为参照峰，检测峰中间横线代表文库 片段范围。
【具体实施方式】
[0044] 下面结合具体实施例进一步阐述本方法发明。运些实施例仅用于说明本发明而不 用于限制本发明要求保护的范围。下列实施例中未注明具体实验条件和方法，实验条件和 方法参照相关试剂说明书或者《分子克隆实验指南》（第3版）（J.萨姆布鲁克，化W.拉塞 尔主编，2008出版）。
[0045] 实施例1光溫敏不育系水稻武香S(WX巧和常规稻9311的MSAP-seq文库制备
[0046] 材料背景：武香S(WX巧为水稻光溫敏不育系水稻，长日照高溫不育，短日低溫可 育，育性受光溫调控，属于表观遗传学范畴。表观遗传学是研究基因的核巧酸序列不发生改 变的情况下，基因表达的可遗传变化的一口遗传学分支学科。9311为水稻釉稻常规稻，长日 照高溫、短日低溫均为可育，9311为阳性对照。
[0047] 样品处理与取材：
[004引表2.样品处理
[0049]
[0050] 9311两组材料为阴性对照，作为背景杂除；WXS两组材料为阳性对照。分别取上述 四种样本的叶片、幼穗和茎Ξ个组织，共12份材料，每份材料对应的barcode的序列和预混 样后的指示标签序列如下表。
[0051] 表3.水稻武香S(WX巧和9311MSAP-seq文库制备中条码度arcode)和（指示标 签）信息表
[0052]
[0053]
[0054]MASP-seq文库构建包括W下步骤：
[005引 （l)DNA样品的提取。利用2XCTAB提取液提取水稻WXS和9311不同处理的12种 组织中的基因组DNA。经化aseUFermentas，美国）处理，进行酪仿（体积比1:1)抽提和 75% (体积百分比）乙醇沉淀后，将纯化的基因组DNA溶于50μΙTE缓冲液中。
[0056] (2)双酶切与磁珠纯化。每种组织的DNA分别利用EcoRI+MspI(肥Β公司，美国） 和EcoRI+地all(肥B公司，美国）进行双酶切。酶切体系50yL:基因组DNA100ng，EcoRI、 MspI和HapII酶量分别为20U、10U和10U。酶切条件是37°C化。然后选用AgencourtAMPure XP磁珠对每种酶切后的产物进行纯化，纯化时往50μL酶切产物中加入80μLAMPureXP 磁珠（即磁珠的加入量为纯化目标体积的1.6X)，利用磁力架吸附磁珠，80%的酒精漂洗 磁珠两次，室溫惊干5min后，用30μLTE洗脱DNA片段。
[0057] (3)接头连接与磁珠纯化。利用T4DNA连接酶连接EcoRI接头、上述纯化的各酶切 样本和MspI/化all(MspI与化all为同工酶，接头一样）。保证每种样本的起始连接量一 致，且选取不同的MspI/化all接头连接不同的样本。连接体系40μL:MspI/化all接头和 EcoRI接头终浓度1μM，T4DNA连接酶为40U，保证每种酶切样本连接时的DM起始量相同 (均为90ng)。EcoRI接头序列为：
[0058]F(5' -3' ) :ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTNNN順，
[0059]R(5, -3,）：/5I%os/AATTNNNNNAGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT;
[0060]Mspl/Hpall接头序列为：
[0061]F(5' -3' ):GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT，
[0062]R(5, -3, ) :/5Phos/CGAGATCGGAAGAGCGAGAACAA。
[0063]NNNNN为条码序列，每种样本对应的条码序列见表3,共有12种，引物合成采用 PAGE纯化，部分引物5'端进行憐酸化修饰。
[0064] (4)混样与片段选择。将EcoRI+MspI双酶切连接组的12个样本按照体积等量混 合成一个池（pooling)，共480μL标记为MspI组；EcoRI+地all双酶切连接组的12个样 本等量混合成第二个池，共480μ以标记为化all组。通过磁珠对运两个池样品分别进行 磁珠纯化，AMPureXP磁珠用量为1.6X即768μL。纯化的样品进行2%琼脂糖凝胶电泳 (120V，化），回收300~400bp之间的片段，最终用23μLTE溶解。
[0065] 巧)PCR扩增和胶回收。将上述回收的片段23μL进行PCR扩增，扩增酶选用 Q5化Fi热启动酶（肥Β，美国），PCR引物序列为：
[0066]F(5, -3, ） ：AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACG，
[0067]R(5，-3，）：CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATNNNNNNGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGC。
[006引 PCR引物R序列中的NNNN順代表指示标签序列，共有2种，具体序列见表2,用于 扩增不同pooling文库。
[0069] PCR扩增体系50μL:23μL回收产物，25μLQ5HiFi热启动酶mix，1.0μLPCRF 引物（15μΜ)，1.0μΙPCRR引物（15μΜ)。
[0070]PCR扩增程序为：98°Clmin，l个循环；98°C10s，65°C60s，72°C30s，10 循环； 72°C5min，1个循环；4°C终止反应。扩增后的PCR产物进行2%琼脂糖凝胶电泳（120V， 50min)，回收350~450之间的片段，最终用18μLTE溶解。回收的产物分别记为MspI文 库和化all文库。
[0071] (6)文库质检。分别从MspI文库和化all文库各取1μL利用安捷伦2100核酸 分析仪进行毛细管电泳检测。再各取1μ以利用如bit2. 0核酸定量检测仪进行浓度定量 检测。安捷伦2100核酸分析仪检测结果如图2所示。从图2中可W看出化all组（图A) 和MspI组（图B)文库片段范围均处于350~450bp之间，检测浓度分别为2. 46ng/μL和 5. 1化g/μ以文库片段范围和浓度符合上机测序要求。
[0072] 实施例2香精树新叶和成熟叶的MSAP-seq文库制备
[0073] 样品取材：在武汉大学校生科院旁边选取Ξ个棵长势健康的香精树，分别取Ξ 片新鲜叶片和Ξ片成熟叶片，制备研究同一组织的不同发育时期的甲基化状态变化的 MSAP-seq文库。
[0074] 表4.香精树新叶和成熟叶MSAP-seq文库制备中条码度arcode)和指示标签信息 表
[00 巧]
[0076]
[0077] 注：由于样品较少，可W将样品混合成一个池，共用一个指示标签PCR引物，节约 建库和测序成本。
[0078] 具体MSAP-seq文库制备流程如下：
[0079] (l)DNA样品的提取。利用2XCTAB提取液提取精树新鲜叶和成熟叶组织的基因组 DNA。经酪仿（体积比1:1)抽提、化aseUFermentas，美国）处理和75% (体积百分比）乙 醇沉淀后，将纯化的基因组DM溶于50μLTE中。测定DM浓度，保证基因组DM起始酶 切量相同。
[0080] 似双酶切与磁珠纯化。两种叶片组织的基因组DNA分别利用EcoRI+MspI(肥B 公司，美国）和EcoRI+地all(肥B公司，美国）进行双酶切，酶切体系为50yL:基因组 DNA500ng，EcoRI、MspI和化pll酶量分别为20U、10U和10U。酶切条件是37°C化。酶切产 物用磁珠对每种酶切后的产物进行磁珠纯化，AMPureXP磁珠用量为1.6X即80yL。利用 磁力架吸附磁珠，80%的酒精漂洗磁珠两次，惊干5min后，用30μLTE洗脱DNA片段。
[0081] (3)接头连接与磁珠纯化。利用T4DNA连接酶连接EcoRI接头、