一种从发酵液中提取尼莫克汀的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及药物化学领域。具体而言，本发明涉及一种从发酵液中提取尼莫克汀的方法，更尤其，本发明涉及一种结合使用陶瓷膜、树脂柱并结合使用有机溶剂将发酵液中的尼莫克汀以异常高的收率提取出来的方法。
【背景技术】
[0002]尼莫克汀(Nemadectin)是一种十六元大环内酯类抗生素，由蓝灰链霉菌(Streptomycescyaneogriseus sp.Noncyanogenus)经发酵过程生产。作为米尔贝霉素族的一员，尼莫克汀主要用于合成莫西克汀(Moxidectin)，后者是一种大环内酯类的农用抗生素，主要用于治疗牛羊等动物体内的寄生虫病。
[0003]欧洲专利EP0170006A2公开了一种尼莫克汀的生产培养基与发酵工艺，首先将蓝灰链霉菌接种于含葡萄糖1.0%、糊精2.0%、酵母浸出物0.5%、NZ胺(酪蛋白的酶促水解物)0.5%和碳酸钙0.1 %的培养基中(各物质的百分含量单位是g/mL，例如0.1 %即0.001g/mL，指100mL溶液中含有0.lg溶质，这是生化领域中将固体物质配制成溶液试剂时通用的浓度表示方法)，28°C培养48-72h，作为一级种子；将一级种子接入同样的培养基，28°C培养48h，作为二级种子；然后将1L 二级种子液接入含糊精1.0%、大豆蛋白胨1.0%,糖蜜1.0%、碳酸钙0.1%的培养基30L中，于30°C发酵培养，发酵罐的空气流量30L/min，罐压8磅，搅拌500rpm，培养91h后放罐。该发明同时公开了发酵液中包括尼莫克汀及其结构类似物在内的发酵产物的分离纯化方法:对发酵液加硅藻土为助滤剂过滤得到湿菌丝渣；用甲醇萃取湿菌丝渣；萃取液经浓缩后再用二氯甲烷萃取；收集二氯甲烷相经无水硫酸钠干燥、浓缩，再经硅胶柱层析得到尼莫克汀。该方法的缺陷在于，由于过滤发酵液困难而使用了大量助滤剂，产生大量过滤废水，导致环境污染；使用甲醇萃取湿菌丝渣，甲醇的用量过大；而且使用一次性硅胶分离尼莫克汀，提取成本较高。
[0004]目前从发酵液中提取尼莫克汀的方法基本是(1)用板框压滤机或离心机实现菌丝体和水相的分离，用有机溶剂浸泡菌丝体提取脂溶性目标组分。上述方法的缺点是板框的装拆、物料的卸出和滤布的清洗都为手工操作，并且辅助时间长，劳动强度大，生产效率低，从而影响整个生产的进度；部分游离在水相中的脂溶性目标组分在菌丝体和水相分离时随水相进入废水中；操作对环境不友好，有机溶剂耗用量大；因菌丝体中成分复杂，在有机溶剂提取过程中易造成大量乳化，进而影响收率和质量。(2)用有机溶剂直接在发酵液中浸提尼莫克汀。上述方法的缺点是溶剂耗用量大(例如乙醇、甲醇等)，易乳化；同时需要使用到大量的助滤剂，既增加成本也增加人工劳动强度，同时还会造成环境污染。上述方法处理后往往产品滤液的质量不高,增加后面的工艺负荷,如增加树脂柱的处理时间,增加柱子的再生频率，降低其使用寿命等。
[0005]现代膜分离技术起源于20世纪60年代，是一种新型的流体分离单元操作技术。它以高分子分离膜为分离介质，以压力差、浓度差、电位差等为传质驱动力，将待分离流体中的不同物质按照分子量、颗粒或电荷的不同进行分离。由于膜分离技术具有高效节能等特点，自第一套工业化设备推向市场以来，得到了迅猛发展，目前已遍及几乎所有工业领域。按照膜分离的不同原理，可以把膜分成过微滤膜、超滤膜、纳滤膜、反渗透膜、透析膜、电渗析膜、渗透汽化膜以及气体分离膜等不同种类。
[0006]目前尚未发现有采用膜分离技术，特别是陶瓷膜来浓缩发酵液，进而提取尼莫克汀的报道。
[0007]应用大孔吸附树脂进行分离的技术是20世纪60年代末发展起来的继离子交换树脂后的分离新技术之一。大孔吸附树脂是一种不含离子基团的网状结构的高分子聚合物吸附剂，具有吸附性强、解吸附容易、机械强度好、可反复使用、流体阻力小等优点，其分离性能与树脂本身性质、溶剂因素和被分离的化合物性质等有关。随着在药物化学成分提取、分离、富集中的进一步应用，大孔吸附树脂必将有利于药物制剂工艺的改进，有利于促进药物现代化研究的进程。
[0008]目前也未发现大孔吸附树脂与膜分离技术结合来从发酵液中提取尼莫克汀的报道。
[0009]
【发明内容】
[0010]本发明致力于提供一种更简单有效、环保、成本低的用于从发酵液中以高收率提取尼莫克汀的方法，即使发酵液的质量很差。
[0011]用于从发酵液中提取尼莫克汀的本发明的方法包括:
a)用陶瓷膜浓缩发酵液，任选，接着
b)向发酵液浓缩液中持续加入或间歇加入一种或数种选自醇、二醇、酮、酯类、羧酸类有机溶剂或上述溶剂与水的混合物，并使用陶瓷膜浸提，获得尼莫克汀浸提液。
[0012]根据本发明的方法，还包括:
c)用大孔吸附树脂富集尼莫克汀浸提液得尼莫克汀浓缩液。
[0013]本发明涉及一种从发酵液中提取尼莫克汀的方法，更尤其，本发明涉及一种结合使用陶瓷膜、大孔吸附树脂柱等设备，用有机溶剂将发酵液中的尼莫克汀以异常高的收率提取出来的方法。
[0014]总的来说，从发酵液中提取尼莫克汀的方法包括用陶瓷膜浓缩发酵液，向发酵液浓缩液中持续加入一种或数种选自醇、二醇、酮、酯类、羧酸类有机溶剂或上述溶剂与水的混合物并使用陶瓷膜浸提后得尼莫克汀浸提液，用大孔吸附树脂富集浸提液得尼莫克汀浓缩液。
[0015]以下具体描述根据本发明的从发酵液中提取尼莫克汀的方法。
[0016]步骤a)，用陶瓷膜浓缩发酵液。
[0017]所述发酵液是任何用现有技术方法获得的其中含有尼莫克汀的发酵液，其色谱纯度例如可以达到50?80%，优选55?70%，例如其色谱纯度为60%或61% ;该发酵液具有一定效价，例如1000?3000μ g/ml，优选1500?2500 μ g/ml，更优选1800?2200 μ g/ml，例如其效价为 1972 μ g/ml、2050 μ g/ml 或 2180 μ g/ml。
[0018]本发明采用的陶瓷膜是微滤膜中的一种，主要是指由氧化铝(A1203)、氧化锆(Zr02)、二氧化钛(Ti 02)和/或二氧化硅(Si02)等无机材料制备的多孔膜，并有多孔道式、平板式或管道式等形式，膜孔径一般为1 一 200nm，优选3 — lOOnm，更优选5 — 50nm，例如50nmo
[0019]非限定性地，本发明可以采用的陶瓷膜的规格例如:Palll960型膜芯，19通道，通道孔径d=6mm,膜孔径D=50nm,膜芯长L=1?1.2m,过滤面积S=0.358?0.42m2。
[0020]本发明采用的陶瓷膜在使用过程中置于处理罐中，处理罐上可以配备试验机离心泵，其规格例如:H=36m，Q=10T/h，P=3kW。
[0021]陶瓷膜也可以装有多个膜筒放置陶瓷膜芯，例如2?10个膜筒，优选3?8个膜筒，更优选4?6个膜筒。例如当单支过滤面积S=0.42m2时，可以设有6个膜筒，每个膜筒内有36支膜芯，总面积S=90.72 m2，供料泵:H=30m, Q=150T/h，P=30kW，加压泵:H=30m,Q=1580m3/h，P=220kW。
[0022]本发明之所以采用陶瓷膜，是因为陶瓷膜具有化学稳定性好，能耐酸、耐碱、耐有机溶剂；机械强度大，可反向冲洗；抗微生物能力强，耐高温，孔径分布窄，分离效率高等特点。而且陶瓷膜是自动运行，并且运行周期短，劳动力成本低。一定溶剂浓度条件下，陶瓷膜即可实现发酵液有效成分的透出，并且透出液经过大孔吸附树脂富集后的流出液可套回至陶瓷膜浸提，大大节省了溶剂的使用量，同时也大大简化了现有的工艺，省去了大量的助滤剂，也不会引入二次污染，实现清洁生产，从而减轻了环保压力！另外，陶瓷膜具有更细小的孔径，滤液品质大大提高，不但可以去除菌体，除去蛋白等杂质，还可以减轻后续工段的压力。陶瓷膜若结合使用树脂柱可使得尼莫克汀收率异常提高。
[0023]在步骤a)中，陶瓷膜浓缩过程中可向发酵液中加入水、表面活性剂、酸、碱、有机溶剂或者改变发酵液温度。
[0024]根据本发明，经步骤a)浓缩后，通常可以将发酵液体积缩小到约1/2?1/5，优选1/3?1/4。例如，55L的尼莫克汀发酵液经装有陶瓷膜的处理罐进行浓缩，陶瓷膜透出端透出39L水后得发酵液浓缩液16L，或者更大规模，例如180L的尼莫克汀发酵液经装有陶瓷膜的处理罐进行浓缩，陶瓷膜透出端透出126L水后得发酵液浓缩液54L，或者更大规模，例如21m3的尼莫克汀发酵液经装有陶瓷膜的处理罐进行浓缩，陶瓷膜透出端透出15m3水后得发酵液浓缩液6m3。从而大大降低了后处理难度。
[0025]发明的步骤b)中，向发酵液浓缩液中持续加入或间歇加入一种或数种选自醇、二醇、酮、酯类、羧酸类有机溶剂或上述溶剂与水的混合物，并使用陶瓷膜进行浸提，从而获得尼莫克汀浸提液。
[0026]步骤b可以在步骤a)陶瓷膜浓缩过程中进行，也可以在步骤a)陶瓷膜浓缩过程结束后进行。
[0027]根据本发明，可向上述发酵液或发酵液浓缩液中加入水、表面活性剂、酸、碱、有机溶剂与水的混合物，或者改变发酵液温度，从而改变发酵液性质。
[0028]浸提溶剂可以选自醇，例如:甲醇、乙醇、异丙醇；二醇，例如:1，3_丙二醇；酮类，例如:丙酮；酯类，例如:乙酸乙酯、乙酸丁酯；羧酸类，例如:乙酸。
[0029]浸提用的溶剂可以直接应用一种或数种混合使用，也可以是一种或数种与水混合使用，其中水的比例是1%到60%(V:V)。
[0030]在一个优选的实施方案中，浸提使用的有机溶剂是甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯、乙酸。
[0031]在一个更优选的实施方案中，浸提使用的有机溶剂是甲醇、乙醇，浸提使用有机溶剂特点是含有约1%~60%(V:V)的水。
[0032]根据本发明，步骤b)可以重复进行多次，优选重复2?10次，更优选重复3?5次。例如当向16L发酵液浓缩液加入48L甲醇，经陶瓷膜过滤，在陶瓷膜透出侧得尼莫克汀甲醇浸提液后，当罐内料液体积少于30L时，持续向陶瓷膜处理罐中加入75%甲醇来浸提。其他规模情况下的操作类似。
[0033]本发明的步骤c)中，用大孔吸附树脂富集尼莫克汀浸提液，从而获得尼莫克汀浓缩液。
[0034]步骤b)获得的浸提液可以先转移至上柱液暂存罐，然后将上柱液暂存罐里的浸提液加入大孔吸附树脂柱中，也可以直接将浸提液加入大孔吸附树脂柱中，优选通过泵送方式加入。
[0035]根据本发明，可使用的现有技术任何常用的大孔吸附树脂柱，所述大孔吸附树脂是一种不含离子基团的网状结构的高分子聚合物吸附剂，优选HB60、XAD-1600、D101，更优选HB60树脂柱，其规格例如:粒度范围0.3-1.25