多糖143g。经高效凝胶色谱法（HPGPC)检测为均一多糖，其重 均分子量为17600Da。
[0029] 实施例3 :-种螺旋藻多糖的制备方法，具体为：
[0030] 取螺旋藻2Kg，加入60L0. 5mol/L的化OH溶液，于60°C的溶液溫度下揽拌提取2 小时；冷却后，加6mol/L肥1溶液调节抑值为3 ;离屯、得上清液。将上清液浓缩到约5L，加 入15L的95%食用乙醇，静置12小时，离屯、收集沉淀，得螺旋藻粗多糖313邑。
[0031] 取上述螺旋藻粗多糖200g，加水化溶解；在35°C水浴下，加入0. 5mol/L化C1、 0. 5mol/LNaAc;4.Ommol/L乙酸；匀速滴加化10%肥02 ;反应4小时，待反应终止后，进行 超滤处理，得到螺旋藻均一多糖144g。经高效凝胶色谱法（HPGPC)检测为均一多糖，其重均 分子量为9500Da。 阳03引实施例4 :螺旋藻多糖对人肝癌细胞Bel7402细胞增殖的抑制作用的应用，具体 为：
[0033] 将人肝癌细胞Bel7402细胞复苏，培养瓶传代培养，待细胞生长到对数生长期，消 化细胞制成细胞悬液，用0. 4%的台吩蓝染色，计数。
[0034] 取对数生长期的细胞WIXlOVmL密度接种于96孔板，37°C，5%C02培养箱中 培养24小时。吸弃培养液，加入200yL不同浓度的螺旋藻多糖溶液（W含10%胎牛血清 RPI1640培养液配制成终浓度分别为100yg/mL、50yg/mL、25yg/mL)，每一浓度设5个平 行孔。培养24小时、48小时、72小时后，每孔加MTS20yL混匀，于37 °C，5 %C02培养箱中 解育4小时，吸弃孔内液体，每孔加入二甲基亚讽200yL，用酶标仪于490nm处测吸光值。 重复实验3次。计算抑制率（实验结果见表1)。
[0035] 细胞生长抑制率（％) = [(对照组平均OD值-用药组平均OD值）/对照组平均 OD值]X100%。
[0036] 表1螺旋藻多糖对Bel7402细胞增殖的抑制作用
[0037]
[0038] 结果显示本发明中螺旋藻多糖对人肝癌细胞Bel7402增殖具有抑制作用，并呈剂 量依赖关系。表明本发明中螺旋藻多糖具有治疗和/或预防肿瘤的潜在应用价值。
[0039] W上实施例的说明只是用于帮助理解本发明及其核屯、思想。应当指出，对于本技 术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可W对本发明进行若干改 进和修饰，运些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。
【主权项】
1. 一种螺旋藻多糖，其特征在于：包括D-葡萄糖醛酸、D-乙酰氨基半乳糖、L-岩藻糖 和半乳糖四种单糖，以摩尔比计，四种单糖比例为：3. 5~4. 5:3. 5~4. 5:1. 7~2. 3:1 ; 所述的螺旋藻多糖的重均分子量范围为：5000~18000Da。2. 如权利要求1所述的螺旋藻多糖，其特征在于：以摩尔比计，四种单糖比例为： 4:4:2:1〇3. 如权利要求1中所述的螺旋藻多糖，其特征在于：包括由1个硫酸软骨素E、7个其 它非硫酸化软骨素及单硫酸化软骨素组成的主链，以α-1，3-糖苷键连接4个L-岩藻糖硫 酸酯形成侧链，末端以α-1，3-糖苷键连接2个半乳糖。4. 如权利要求3中所述的螺旋藻多糖，其特征在于：所述主链是以D-葡萄糖 醛酸和D-乙酰氨基半乳糖硫酸酯以β-1，3-糖苷键和β-1，4-糖苷键链接形成 [_4GlcAi3 1 - 3GalNAc4S/6Si3 1-]硫酸软骨素二糖结构单元，所述螺旋藻多糖结构如下：5. 如权利要求1或2所述的螺旋藻多糖，其特征在于：所述螺旋藻多糖以其碱金属或 碱土金属盐的形式存在。6. 如权利要求5所述的螺旋藻多糖，其特征在于：所述的碱土金属盐是螺旋藻多糖的 钠盐、钾盐或钙盐。7. -种螺旋藻多糖的制备方法，其特征在于：按以下步骤进行： 1) 取螺旋藻适量，加入10~30倍重量体积比的0. 5mol/L的NaOH溶液，于60°C的溶 液温度下搅拌提取2小时；冷却后，加入6mol/LHC1溶液至混合后的溶液pH值为2~3， 离心处理得上清液；将上清液浓缩到约螺旋藻原料重量2倍体积后，加入三倍体积的95% 食用乙醇，静置8-12小时，离心收集沉淀，得螺旋藻粗多糖； 2)向螺旋藻粗多糖中加20~40倍重量体积比的水溶解；在35°C水浴下，分别加入 0· 5mol/L NaCl、0. 5mol/L NaAc、4. Omol/L乙酸后；匀速滴加1~3L 10% H202;待反应终止 后，进行超滤处理，得到螺旋藻纯多糖，该螺旋藻纯多糖包括D-葡萄糖醛酸、D-乙酰氨基半 乳糖、L-岩藻糖和半乳糖四种单糖。8. 如权利要求7所述的螺旋藻多糖的制备方法，其特征在于： 1) 取螺旋藻适量，加入20倍重量体积比的0. 5mol/L的NaOH溶液，于60°C的溶液温度 下搅拌提取2小时；冷却后，加入6mol/LHC1溶液至混合后的溶液pH值为2. 5 ;离心处理 得上清液；将上清液浓缩到约螺旋藻原料重量2倍体积后，加入三倍体积的95%食用乙醇， 静置10小时，离心收集沉淀，得螺旋藻粗多糖； 2) 向螺旋藻粗多糖中加30倍重量体积比的水溶解；在35°C水浴下，分别加入0. 5mol/ LNaCl、0. 5mol/LNaAc;4.Ommol/L乙酸后；匀速滴加2L10%H202 ;待反应终止后，进行超 滤处理，得到螺旋藻纯多糖。9. 一种螺旋藻多糖，其特征在于：采用权利要求7或8所述方法制备，所述螺旋藻多糖 由D-葡萄糖醛酸、D-乙酰氨基半乳糖、L-岩藻糖和半乳糖四种单糖组成；以摩尔比计，四 种组成单糖比例为：3. 5~4. 5:3. 5~4. 5:1. 7~2. 3:1 ;所述螺旋藻多糖的重均分子量范 围为：5000 ~18000Da。10. -种螺旋藻多糖的应用，其特征在于：所述螺旋藻多糖用于制备抗肿瘤药物。
【专利摘要】本发明公开了一种具有抗肿瘤活性的螺旋藻多糖及其制备方法。该螺旋藻多糖衍生物由D-葡萄糖醛酸、D-乙酰氨基半乳糖、L-岩藻糖和半乳糖四种单糖组成，分子量为5000～18000Da，本发明提取的单一螺旋藻多糖对肿瘤细胞有显著的抑制作用，可用于制备抗肿瘤药物。
【IPC分类】A61P35/00, C08B37/00
【公开号】CN105294870
【申请号】CN201510312393
【发明人】谭道鹏, 冯贻东, 于琳, 王春宴, 曾伟珍
【申请人】深圳海王药业有限公司
【公开日】2016年2月3日
【申请日】2015年6月9日