同时鉴别H5N1和H9N2亚型禽流感病毒的GeXP快速检测引物组、试剂盒及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于禽类病毒检测技术领域，尤其涉及一种同时鉴别H5N1和H9N2亚型禽 流感病毒的GeXP快速检测引物组、试剂盒及其应用。
【背景技术】
[0002] 禽流感病毒（Avian influenza virus，AIV)亚型众多，变异频繁，现已发现16种 不同的血凝素亚型（HA)和9种不同的神经氨酸酶亚型（NA)。根据致病力不同，禽流感可分 为高致病性和低致病性，能引起高致病性禽流感发生的主要是H5、H7亚型AIV。1996年，中 国广东的一家鹅场首次爆发H5N1HPAI疫情，此后该病毒在东南亚地区家禽中呈地方流行 性，目前H5N1AIV已蔓延到全世界范围内的60多个国家，每一次爆发都可导致大规模的家 禽死亡或淘汰，给养禽业带来毁灭性的打击。H9N2亚型LPAI -般引起温和的临床症状，以 咳嗽、喷嚏、啰音和喘鸣等呼吸道症状最为常见。目前，大规模的集约化养禽场中H9N2亚型 AIV引起的经济损失十分为严重。研究表明目前家禽体内以H5N1、H9N2为主要流行亚型。 虽然政府已经实施了通过疫苗强制性免疫来控制H5N1和H9N2禽流感病毒，但是由于家禽 数量庞大，不可能对每一只家禽都能够进行很好的免疫接种，加之禽流感病毒本身抗原变 异快，所以H5N1和H9N2禽流感病毒仍然能够在各种禽类中流行并发生抗原漂移。多位学 者的研究证实H5N1和H9N2禽流感病毒目前在鸡群中广为流行，严重制约了家禽业的健康 发展。此外，自从1997年香港发生高致病性H5N1流感病毒感染人以来，H5N1病毒己多次 造成感染人的病例。H9N2亚型禽流感病毒也是感染禽和人最多的禽流感病毒亚型之一。因 此，H5N1和H9N2禽流感病毒还严重威胁人类生命的健康。H5和H9亚型禽流感病毒可以感 染不同日龄的鸡群，具有较高的发病率和死亡率，其感染后鸡群发病的临床症状十分相似 且部分毒株还能够感染人类。此外，鉴于禽流感病毒可以通过空气飞沫等方式传播，具有发 病急和传播速度快等特点，因此建立能迅速、有效的鉴别鸡场主要流行的H5N1和H9N2亚型 禽流感病毒的检测方法不仅对禽流感防制具有重要意义，同时对H5N1和H9N2亚型AIV的 监测及保障人类生命健康具有十分重要的意义。
[0003]目前，禽流感病毒实验室检测技术主要包括病毒的分离及培养、血清学试验、分子 生物学实验和免疫荧光等方法，且病毒的分离与培养是诊断禽流感病毒感染的"金标准"。 由于禽流感亚型众多且新的变异株不断出现，使用上述检测方法对其进行分型和诊断不仅 存在着操作方法复杂，而且检测周期长及容易受抗体等因素影响使得检测结果不能准确和 及时。虽然多重PCR有着能同时扩增出多个目的因片段进而实现多种病原体的快速诊断并 降低检验成本的优点，但是普通多重PCR在扩增的过程中容易受到目的基因模板的特性、 引物浓度和比例及PCR所用的试剂之间的相互作用等的影响，进而导致样品扩增效率不一 致使得检测结果的准确性大大降低。GeXP多基因遗传表达分析系统的多重逆转录聚合酶链 反应（Multiplex reverse transcription-polymerase chainreaction, mRT-PCR)是由通 用引物（上游加荧光标记）和特异性嵌合引物（基因特异性引物5'末端连接通用引物序 列）相结合建立多重逆转录聚合酶链反应体系，采用通用引物引发的策略，可以克服普通 多重PCR存在的扩增效率不一的问题。此外，该方法利用毛细管电泳进行产物的分离，大大 提高了检测结果的灵敏度和可靠性。
[0004] 目前，检测H5和H9亚型禽流感病毒的核酸检测方法至多是针对不同的HA亚型， 而一个反应同时扩增H5、N2、Nl、H9和Μ五个基因来检测和鉴别H5N1和H9N2亚型禽流感 病毒的核酸检测技术尚未见有报道。本研究建立的GeXP多重PCR技术能够在四个小时内 通过一个PCR反应对禽流感病毒的H5N1和H9N2亚型进行检测和分型，达到可以快速诊断 和鉴别H5N1和H9N2亚型禽流感病毒的目的，对H5N1和H9N2禽流感流行病学调查及其防 控，保障人类公共卫生的安全和健康持续发展具有重要意义。
[0005] 公开于该【背景技术】部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不应 当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
【发明内容】
[0006] 为了克服现有技术的不足，本发明建立的GeXP多重PCR技术能够同时对H5N1和 H9N2亚型禽流感病毒进行检测和分型，达到可以快速诊断和鉴别H5N1和H9N2亚型禽流感 病毒的目的，对H5N1和H9N2禽流感流行病学调查及其防控，保障人类公共卫生的安全和健 康持续发展具有重要意义。
[0007] 本发明要解决的技术问题是提供一种同时鉴别H5N1和H9N2亚型禽流感病毒的 GeXP快速检测引物组、试剂盒及其应用。
[0008] 为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：
[0009] 一种同时鉴别H5N1和H9N2亚型禽流感病毒的GeXP引物组，包括5对特异性引物， 分别是引物对M-1和M-2、引物对AIV-H5-1和AIV-H5-2、引物对AIV-H9-1和AIV-H9-2、弓丨 物对 AIV-N1-1 和 AIV-N1-2、引物对 AIV-N2-1 和 AIV-N2-2,其分别具有如 SEQ ID No. 1 至 SEQ ID No. 10所示的序列。
[0010] 作为优选，所述的同时鉴别H5N1和H9N2亚型禽流感病毒的GeXP引物组还包括1 对通用引物，上游通用引物为Cy5-Tag-F，下游通用引物为Tag-R，分别具有如SEQ ID No. 11 至SEQ ID No. 12所示的序列。
[0011] -种同时鉴别H5N1和H9N2亚型禽流感病毒的GeXP试剂盒，包括反转录RT反应 液、PCR反应液、DEPC水和超纯水；所述的反转录RT反应液含有5XReverse Transcriptase Buffer、5Opmol Random Primer (12mer)、lOmM dNTP Mixture、40U Ribonuclease Inhibitor 和 5U/ μ L AMV Reverse Transcriptase ;所述的 PCR 反应液含有 10 X PCR buffer、25mM MgCl2、10mM dNTP Mixture，5对特异性引物混合物，ΙΟμΜ/L上、下游通用引物 混合物，JumpStart Taq DNA Polymerase;所述的5对特异性引物分别是引物对M-1和M-2、 引物对 AIV-H5-1 和 AIV-H5-2、引物对 AIV-H9-1 和 AIV-H9-2、引物对 AIV-N1-1 和 AIV-N1-2、 引物对AIV-N2-1和AIV-N2-2 ; 1对通用引物分别为Cy5-Tag-F和Tag-R，其分别具有如SEQ ID No. 1至SEQ ID No. 12所示的序列。
[0012] 作为优选，所述的5对特异性引物中引物对M-1和M-2、引物对AIV-H5-1和 AIV-H5-2、引物对 AIV-H9-1 和 AIV-H9-2、引物对 AIV-N1-1 和 AIV-N1-2、引物对 AIV-N2-1 和AIV-N2-2在PCR反应体系中对应的的摩尔浓度分别为100nmol/L、50nmol/L、100nmol/L、 50nmol/L、lOOnmol/L ;所述的1对通用引物Cy5-Tag-F和Tag-R在PCR反应体系中的摩尔 浓度为 500nmol/L。
[0013] 作为优选，所述的反转录RT反应液每管9 μ L，含有5 X Reverse Transcriptase Buffer 5 μL、50pmol Random Primer(12mer)lμL、10mM dNTP Mixture 2 μL、40U Ribonuclease Inhibitor 0· 5 μ L 和 5U/μ L AMV Reverse Transcriptase 0.5yL;所述 的 PCR 反应液每管 9.7yL，含有 10XPCR buffer 2.5yL，25mM MgCl2 2.5yL，10mM dNTP Mixture 2 μ L，5对特异性引物混合物1. 25 μ L，10 μ M/L上、下游通用引物混合物1. 25 μ L， JumpStart Taq DNA Polymerase 1· 2 μ L ;所述的 DEPC 水和超纯水各 lmL。
[0014] 本发明还提供了所述的同时鉴别H5N1和H9N2亚型禽流感病毒的GeXP引物组或 所述的同时鉴别H5N1和H9N2亚型禽