同时鉴别感染人的三种H5亚型禽流感病毒组合的GeXP快速检测引物组、试剂盒及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于禽类病毒检测技术领域，尤其涉及一种同时鉴别感染人的三种H5亚 型禽流感病毒组合的GeXP快速检测引物组、试剂盒及其应用。
【背景技术】
[0002] 禽流感是由禽流感病毒引起的一种禽类急性传染病，同时某些亚型禽流感病毒也 能感染人类。禽流感病毒根据其表面糖蛋白血凝素（HA)和神经氨酸酶（NA)的抗原关系差 异，可将其分为16种HA亚型和9种NA亚型。根据其致病性可分为高致病性禽流感和低致 病性禽流感，高致病性禽流感包括H5和H7亚型。特别是近年来频繁爆发的H5亚型禽流感 疫情给许多国家和地区的养禽业带造成了巨大的经济损失。H5亚型禽流感病毒的一些亚型 组合除了其对禽类的高致病性外，还能跨种间传播感染人。1997年香港地区首次出现人感 染H5N1禽流感病例，2003年之后多个国家相继出现H5N1禽流感病毒感染人事件，自2003 年以来，H5N1高致病性禽流感开始在东南亚地区广泛流行，数月间传播到了周边以前未有 该病报道的8个国家。该病在2005年期之前都只在东南亚的动物和人流行感染，但之后病 毒开始从该地区经过中亚传播到了欧洲和中东地区。目前已有16个国家650人感染发病， 患者死亡率高达60%以上。0ΙΕ报道了在至少60个国家的家禽和野生鸟类中暴发了 H5N1 的感染。H5N2亚型禽流感病毒在禽类中广泛存在，该病毒在鸡体内经过传代以后，可以发 生突变，有可能变为高致病性禽流感病毒，同时野鸟和家禽也间接给H5N2亚型低致病性禽 流感病毒在野鸟内的跨种间传播提供了机会。另外，H5N2亚型流感病毒还能够感染哺乳动 物，甚至是人类，对公共卫生安全构成了极大的威胁。据报道日本至少有77人感染低致病 H5N2型禽流感病毒，这些人没有出现感染禽流感病毒的症状。2014年5月中国四川省检测 出一例人感染h5n6禽流感病例，患者死亡，这是全球首例人感染H5N6禽流感的个案。2014 年12月23日，国家卫生计生委向WHO通报广东省发生一例人感染H5N6禽流感实验室确 诊病例，患者经救治后康复。2015年2月9日和2015年7月11日国家卫生计生委分别向 WHO通报云南省发生两例人感染H5N6禽流感实验室确诊病例，两名患者均死亡。上述事实 表明H5N1、H5N2、H5N6三种H5亚型禽流感病毒组合能够感染人，并且H5N1和H5N6亚型组 合可以导致人类死亡。
[0003]目前，禽流感病毒实验室检测技术主要包括病毒的分离及培养、血清学试验、分子 生物学实验和免疫荧光等方法，且病毒的分离与培养是诊断禽流感病毒感染的"金标准"。 由于禽流感亚型众多且新的变异株不断出现，使用上述检测方法对其进行分型和诊断不仅 存在着操作方法复杂，而且检测周期长及容易受抗体等因素影响使得检测结果不能准确和 及时。虽然多重PCR有着能同时扩增出多个目的因片段进而实现多种病原体的快速诊断并 降低检验成本的优点，但是普通多重PCR在扩增的过程中容易受到目的基因模板的特性、 引物浓度和比例及PCR所用的试剂之间的相互作用等的影响，进而导致样品扩增效率不一 致使得检测结果的准确性大大降低。GeXP多基因遗传表达分析系统的多重逆转录聚合酶链 反应（Multiplex reverse transcription-polymerase chainreaction, mRT-PCR)是由通 用引物（上游加荧光标记）和特异性嵌合引物（基因特异性引物5'末端连接通用引物序 列）相结合建立多重逆转录聚合酶链反应体系，采用通用引物引发的策略，可以克服普通 多重PCR存在的扩增效率不一的问题。此外，该方法利用毛细管电泳进行产物的分离，大大 提高了检测结果的灵敏度和可靠性。
[0004] 由于H5N1、H5N2、H5N6三种感染人的H5亚型禽流感病毒组合感染人具有相似的临 床症状，现有的的诊断技术又很难在较短时间内对其作出准确的分型和判定，不利于其防 控及应急措施的制订。目前，检测H5亚型AIV的核酸检测方法多是针对其HA基因，同时检 测H5N1、H5N2、H5N6三种感染人的H5亚型禽流感病毒组合并进行分型的技术尚未见有报 道。
[0005] 公开于该【背景技术】部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不应 当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
【发明内容】
[0006] 为了克服现有技术的不足，本发明建立的GeXP多重PCR技术能够同时对感染人的 H5N1、H5N2和H5N63种亚型组合禽流感病毒进行检测和分型，达到可以快速诊断和鉴别3种 感染人H5亚型禽流感病毒的目的，对3种H5亚型禽流感流行病学调查及其防控，保障人类 公共卫生的安全和健康持续发展具有重要意义。
[0007] 本发明要解决的技术问题是提供一种同时鉴别感染人的三种H5亚型禽流感病毒 组合的GeXP快速检测引物组、试剂盒及其应用。
[0008] 为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：
[0009] 一种同时鉴别感染人的三种H5亚型禽流感病毒组合的GeXP快速检测引物组，包 括5对特异性引物，分别是引物对A1和A2、引物对B1和B2、引物对C1和C2、引物对D1和 D2、引物对E1和E2,其分别具有如SEQ ID No. 1至SEQ ID No. 10所示的序列。
[0010] 作为优选，所述的同时鉴别感染人的三种H5亚型禽流感病毒组合的GeXP快速检 测引物组，还包括1对通用引物，上游通用引物为Cy5-Tag-F，下游通用引物为Tag-R，分别 具有如SEQ ID No. 11至SEQ ID No. 12所示的序列。
[0011] 一种同时鉴别感染人的三种H5亚型禽流感病毒组合的GeXP快速检测试剂 盒，包括反转录RT反应液、PCR反应液、DEPC水和超纯水；所述的反转录RT反应液含有 5XReverse Transcriptase Buffer、50pmol Random Primer(12mer)、10mM dNTP Mixture、 40U Ribonuclease Inhibitor 和 5U/μ L AMV Reverse Transcriptase;所述的 PCR 反应 液含有 10XPCR buffer、25mM MgCl2、10mM dNTP Mixture，5 对特异性引物混合物，ΙΟμΜ/L 上、下游通用引物混合物，JumpStart Taq DNA Polymerase;所述的5对特异性引物分别是 引物对A1和A2、引物对B1和B2、引物对C1和C2、引物对D1和D2、引物对E1和E2 ;1对通 用引物分别为Cy5-Tag-F和Tag-R，其分别具有如SEQ ID No. 1至SEQ ID No. 12所示的序 列。
[0012] 作为优选，所述的5对特异性引物中引物对A1和A2、引物对B1和B2、引物对C1和 C2、引物对D1和D2、引物对E1和E2在PCR反应体系中对应的的摩尔浓度分别为150nmol/ L、150nmol/L、150nmol/L、200nmol/L、150nmol/L ;所述的 1 对通用引物 Cy5_Tag_F 和 Tag-R 在PCR反应体系中的摩尔浓度为500nmol/L。
[0013] 作为优选，所述的反转录RT反应液每管9 μ L，含有5 X Reverse Transcriptase Buffer 5 μL、50pmol Random Primer(12mer)lμL、10mM dNTP Mixture 2 μL、40U Ribonuclease Inhibitor 0· 5 μ L 和 5U/μ L AMV Reverse Transcriptase 0.5yL;所述 的 PCR 反应液每管 9.7yL，含有 10XPCR buffer 2.5yL，25mM MgCl22.5yL，10mM dNTP Mixture 1 μ L，5对特异性引物混合物1. 25 μ L，10 μ M/L上、下游通用引物混合物1. 25 μ L， JumpStart Taq DNA Polymerase 1· 2 μ L ;所述的 DEPC 水和超纯水各 lmL。
[0014] 本发明还提供了所述的同时鉴别感染人的三种H5亚型禽流感病毒组合的GeXP快 速检测引物组或所述的同时鉴别感染人的三种H5亚型禽流感病毒组合的GeXP快速检测试 剂盒在鉴别H5N1、H5N2和H5N6亚型禽流感病毒中的应用。
[0015] 与现有技术相比，本发明