物验证的相同。
[0047] 2. 4 结果
[0048] 5对引物对1-5混合后分别对单一 cDNA或混合cDNA进行检测。
[0049] 如图1所示，结果表明多引物单模版分别检出了 161.67bp、188.59bp、210.99bp、 224. 56bp、240. 32bp的扩增产物，阴性对照无任何扩增产物；多引物多模板结果表明5个靶 基因可被同时检出，经GeXP system多重检测体系分析，可检出与实际相符的5个目的峰且 无其他杂峰，同时可通过产物片段大小来区分所检测的H5N1、H5N2和H5N6亚型禽流感病 毒。结果也验证了多重检测检测体系中的引物特异性。
[0050] 实施例3 :GeXP system多重检测体系特异性检测
[0051] 按照MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver. 5. 0说明书从尿囊液中分别 提取HA(1-16)和ΝΑ(1-9)亚型禽流感病毒核酸，同时提取IBV、NDV和ILTV等禽类常见病毒 的核酸分别加入到实施例2建立的GeXP多重检测体系中，检测该方法的特异性。多重PCR 完成后，PCR产物上机进行GeXP毛细管电泳分析，结果显示每个反应只出现特异信号，无交 叉反应。HA基因除H5亚型，NA基因除Nl、N2和N6亚型外的其他NA亚型，以及NDV、IBV、 ILTV和空白对照均无反应信号，提示所建立的方法特异性强，与其他检测对象无交叉反应。
[0052] 实施例4 :GeXP system多重检测体系的灵敏度试验和检测临床样本能力的分析
[0053] 4. 1 GeXP system多重检测体系的灵敏度试验
[0054] 用 Promega 公司 RiboMAXTM Large Scale RNA Production System_T7 试剂盒（目 录号P1300)按其说明书分别使用Spel和PvuII对实时例2中构建的含有M、H5、N1、N2和 N6基因的质粒进行酶切，将上述5个含有不同目的基因线性化质粒进行体外转录合成RNA。 利用DU 800UV/Vis分光光度计对体外转录RNA浓度进行测定和定量。根据核酸浓度和分 子量计算RNA的拷贝数。将M、H5、Nl、N2和N6基因的体外转录RNA等比例混合后进行10 倍连续稀释至1〇6_1〇拷贝/ μ L。以稀释产物为待检测样品，以实施例2建立的方法进行 GeXP多重检测体系灵敏度的检测与分析。试验在不同日重复3次。
[0055] 非同日的3次重复试验表明，该方法对于Μ、H5、Nl、N2和N6基因最低可以检测至 100拷贝/yL的核酸样本。
[0056] 4. 2 GeXP system多重检测体系检测临床样本的能力
[0057] 从实施例1随机选择H5N1和H9N2亚型禽流感病毒的cDNA，经实施例2中步骤二 的方法进行检测。
[0058] H5N6亚型禽流感病毒的检测结果如图2,可以同时检测出211.0U223.93和 240. 17三个目的峰且无其他杂峰，表明样品中只含有H5N6亚型禽流感病毒的模板，与实际 相符。
[0059] H5N1亚型禽流感病毒的检测结果如图3,可以同时检测出161. 52、210. 71和 224. 49三个目的峰且无其他杂峰，表明样品中只含有H5N1亚型禽流感病毒的模板，与实际 相符。
[0060] 前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述 并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变 和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应 用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及 各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。
[0061]
【主权项】
1. 一种同时鉴别感染人的三种H5亚型禽流感病毒组合的GeXP快速检测引物组，其特 征在于：包括5对特异性引物，分别是引物对A1和A2、引物对B1和B2、引物对C1和C2、弓丨 物对D1和D2、引物对E1和E2,其分别具有如SEQIDNo. 1至SEQIDNo. 10所示的序列。2. 根据权利要求1所述的同时鉴别感染人的三种H5亚型禽流感病毒组合的GeXP快速 检测引物组，其特征在于：还包括1对通用引物，上游通用引物为Cy5-Tag_F，下游通用引物 为Tag-R，分别具有如SEQIDNo. 11至SEQIDNo. 12所示的序列。3. -种同时鉴别感染人的三种H5亚型禽流感病毒组合的GeXP快速检测试剂盒， 包括反转录RT反应液、PCR反应液、DEPC水和超纯水；所述的反转录RT反应液含有 5XReverseTranscriptaseBuffer、50pmolRandomPrimer(12mer)、10mMdNTPMixture、 40URibonucleaseInhibitor和 5U/μLAMVReverseTranscriptase;所述的PCR反应 液含有 10XPCRbuffer、25mMMgCl2、2.5mMdNTP]\^1丨11代，5对特异性引物混合物，1(^]\1/ L上、下游通用引物混合物，JumpStartTaqDNAPolymerase;其特征在于：所述的5对特 异性引物分别是引物对A1和A2、引物对B1和B2、引物对C1和C2、引物对D1和D2、引物对 E1和E2 ; 1对通用引物分别为Cy5-Tag-F和Tag-R，其分别具有如SEQIDNo. 1至SEQID No. 12所示的序列。4. 根据权利要求3所述的同时鉴别感染人的三种H5亚型禽流感病毒组合的GeXP快速 检测试剂盒，其特征在于：所述的5对特异性引物中引物对A1和A2、引物对B1和B2、引物 对C1和C2、引物对D1和D2、引物对E1和E2在PCR反应体系中对应的的摩尔浓度分别为 150nmol/L、150nmol/L、150nmol/L、200nmol/L、150nmol/L;所述的 1 对通用引物Cy5_Tag_F 和Tag-R在PCR反应体系中的摩尔浓度为500nmol/L。5. 根据权利要求3所述的同时鉴别感染人的三种H5亚型禽流感病毒组合的GeXP 快速检测试剂盒，其特征在于：所述的反转录RT反应液每管9yL，含有5XReVerSe TranscriptaseBuffer5yL、50pmolRandomPrimer(12mer) 1μL、lOmMdNTPMixture 2yL、40URibonucleaseInhibitor0· 5μL和 5U/μLAMVReverseTranscriptase 〇.5yL;所述的PCR反应液每管 9.7yL，含有lOXPCRbuffer2.5yL，25mMMgCl2 2.5yL， lOmMdNTPMixture1μL，5对特异性引物混合物1. 25μL，10μM/L上、下游通用引物混合 物 1. 25μL，JumpStartTaqDNAPolymerase1. 2μL;所述的DEPC水和超纯水各lmL〇6. 根据权利要求1所述的同时鉴别感染人的三种H5亚型禽流感病毒组合的GeXP快速 检测引物组或权利要求2-5任一所述的同时鉴别感染人的三种H5亚型禽流感病毒组合的 GeXP快速检测试剂盒在鉴别H5N1、H5N2和H5N6亚型禽流感病毒中的应用。
【专利摘要】本发明属于禽类病毒检测技术领域，本发明公开了一种同时鉴别感染人的三种H5亚型禽流感病毒组合的GeXP快速检测引物组、试剂盒及其应用。发明人基于GeXP系统研究设计了5对特异性引物和1对通用引物，据此建立了同时鉴别感染人的三种H5亚型禽流感病毒组合的GeXP快速检测试剂盒。应用本发明可同时鉴别感染人的三种H5亚型H5N1、H5N2和H5N6禽流感病毒，灵敏度为102拷贝/μL。本发明具有高通量、特异性强、灵敏度高且快速等优点，对三种H5亚型禽流感病毒的流行病学调查及其鉴别诊断具有重要意义。
【IPC分类】C12N15/11, C12Q1/70, C12Q1/68
【公开号】CN105316431
【申请号】CN201510843648
【发明人】谢芝勋, 李孟, 谢志勤, 罗思思, 谢丽基, 黄莉, 邓显文, 黄娇玲, 范晴, 张艳芳, 曾婷婷, 王盛
【申请人】广西壮族自治区兽医研究所
【公开日】2016年2月10日
【申请日】2015年11月27日