新型阳离子聚合物纳米材料基因载体及制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及基因治疗领域，具体涉及一种可高效转染干细胞的新型阳离子聚合物 纳米材料基因载体及其构建和应用。
【背景技术】
[0002] 随着现代医学与分子生物学的快速发展，基因治疗作为一种新型治疗癌症的手段 逐渐走向成熟。基因治疗一般包括Η个部分：具有功能性的基因（治疗基因）、携带治疗基 因的载体（基因递送系统）和治疗基因的作用位点（祀细胞）。
[0003] 目前，基因递送系统主要分为病毒载体和非病毒载体两大类。常见的病毒载体主 要有：慢病毒、逆转录病毒、单纯疮疹病毒、腺病毒和腺相关病毒。非病毒基因载体主要包 括：脂质体、聚合物和脂质体-聚合物Η大类。与病毒基因载体相比，非病毒载体具有明显 的优势，基因负载量不受限制（从20bp到100化Ρ的核巧酸或者质粒都可W有效地负载）， 生物安全性好，没有潜在的传染性，免疫原性低，合成方法简单，可W大量制备、成本低廉。
[0004] 在聚合物基因载体中，W阳离子聚合物应用最为广泛，因其结构的正电荷能与带 负电荷的基因静电作用而形成稳定复合物，表面正电荷可与细胞膜表面的负电荷发生静电 吸附而促进细胞内吞。
[0005] 阳离子聚合物不仅能携带基因，还能同时携带治疗药物（阿霉素，顺笛，喜树碱 等），因此，在癌症治疗中，其应用前景显得尤为突出，它是未来非病毒载体多功能化发展的 方向。
[0006] pDNA和siRNA是非病毒基因载体系统中常用的两种，其递送载体的设计重点并不 完全一致。表现为；pDNA更需要递送载体的致密包裹性能；siRNA则需要大容量的负荷性能 和较高的复合体稳定性。而现在大部分已构建的阳离子聚合物基因载体不能同时有效递送 pDNA和siRNA。
[0007] 因此本领域尚需研发新型的阳离子聚合物基因载体，能够有效递送pDNA和 SiRNA,扩大应用范围。
【发明内容】
[0008] 本发明的目的在于提供一种新型的阳离子聚合物基因载体。
[0009] 本发明的第一方面，提供一种共聚物，所述共聚物包括聚己二醇核芯W及与所述 聚己二醇核芯共价连接的（a)聚赖氨酸嵌段、化）聚赖氨酸嵌段和聚组氨酸嵌段；或（C)由 赖氨酸单体、组氨酸单体和任选的氨基酸单体聚合形成的无规或交替聚合物区段。
[0010] 在另一优选例中，所述共聚物的通式为式I:
[0011] C-(Z)x讯
[0012] 其中，C为聚己二醇核芯；
[0013] Z为A-B或W，其中A为聚赖氨酸嵌段；B为聚组氨酸嵌段；
[0014] 或者W为由赖氨酸单体、组氨酸单体和任选的氨基酸单体聚合形成的无规或交替 聚合物区段；
[001引X为的正整数。
[0016] 在另一优选例中，所述共聚物具有W下一个或多个特征：
[0017] (1)所述聚己二醇核芯的分子量为1000-5000g/mol。
[0018] (2)所述聚赖氨酸嵌段的重复单元数为40-150,较佳地为45-120。
[0019] (3)所述聚组氨酸嵌段的重复单元数为0-50,较佳地为10-30。
[0020] (4)所述共聚物的粒径为50-100纳米。
[0021] (5)所述共聚物的平均水合粒径为190-210纳米。对应的电位在5-20mV。
[0022] (6)所述共聚物形成胶束的CMC值为35-50mg/L。
[0023] 在另一优选例中，所述聚赖氨酸嵌段中，赖氨酸的含量> 80%，较佳地> 90%，更 佳地为100%。
[0024] 在另一优选例中，所述聚组氨酸嵌段中，组氨酸的含量> 80%，较佳地> 90%，更 佳地为100%。
[00巧]在另一优选例中，共聚物的结构如式la所示，
[0026]
[0027] 式中，η为40-150,m为0-50。在另一优选例中，η为45-120 ;和/或m为10-30。
[0028] 应注意的是，上述结构式仅是本发明的共聚物的结构示意，用于说明共聚物中包 含有聚己二醇核芯、η个赖氨酸单体单元和m个组氨酸单体单元，其中赖氨酸单体单元和组 氨酸单体单元可W无规排列，交替排列、也可W为嵌段形式排列。
[0029] 本发明的第二方面，提供第一方面所述的共聚物的制备方法，所述方法包括W下 步骤：
[0030] (i)mPEG-COOH与脫胺反应生成mPEG-SS-NHz;
[0031] (iUmPEG-SS-NHz和Lys(Cbz)-NCAW及任选的His度zl)-NCA发生开环反应，再脱 去予氧撰基保护基得到所述共聚物；
[0032]
[003引其中，Lys仰z)-NCA和His(Bzl)-NCA的结构如下所示：
[0034]
[00对各式中，Ri为
[0036] 在另一优选例中，所述步骤（ii)在避光和惰性气体保护下进行开环反应。所述惰 性气体为氮气、氮气、或氮气。在另一优选例中，所述步骤（ii)在无水有机溶剂中进行开环 反应，所述有机溶剂选自选自；四氨巧喃、二氧六环、N，N-二甲基甲醜胺、N，N-二甲基己醜 胺、N-甲基化咯焼丽。在另一优选例中，所述步骤扣）的开环反应温度为15-30。较佳地 为20-25°C。在另一优选例中，所述步骤（ii)的开环反应时间为2-4天。
[0037] 在另一优选例中，Lys(Cbz)-NCA由ε-予氧撰基-心赖氨酸与Η光气反应制得。
[0038] 在另一优选例中，Ν。-予氧撰基-Nim-予基-k组氨酸于氯化亚讽反应生成 化S度zl)-NCA·肥1，用碱去除盐酸后得到化S度zl)-NCA。
[0039] 在另一优选例中，所述步骤（ii)中，在皿r/HAc作用下脱除予氧撰基保护基。
[0040] 本发明的第Η方面，提供第一方面所述的共聚物的用途，用于制备基因递送载体。 [00川在另一优选例中，所述基因为pDNA或siRNA。
[0042] 本发明的第四方面，提供一种复合物，所述复合物包含：
[0043] 第一方面所述的共聚物；和
[0044] 核酸。
[0045] 在另一优选例中，所述复合物的水合粒径为100-220nm。
[0046] 在另一优选例中，所述核酸为pDNA或siRNA。
[0047] 在另一优选例中，所述共聚物与所述核酸的质量比为0. 01-10,较佳地为0. 05-8， 更佳地，为0. 1-6,甚至为0. 5-5。
[0048] 本发明的第五方面，提供第四方面所述的复合物的制备方法，包括W下步骤：
[0049] (a)将第一方面所述的共聚物溶于化C1溶液或磯酸缓冲盐溶液中得到共聚物溶 液；
[0050] 化）将核酸（如pDNA或siRNA)与步骤（a)得到的共聚物溶液混合后得到所述复 合物。
[005。 在另一优选例中，所述化C1溶液的浓度为100-200mM，较佳地为120-180mM。
[0052] 在另一优选例中，步骤（a)得到的共聚物溶液的浓度为0.5-5mg/ml，较佳地为 08-2mg/ml〇
[0053] 本发明的第六方面，提供第四方面所述的复合物的用途，用于制备预防和/或治 疗肿瘤的药物。
[0054] 在另一优选例中，所述肿瘤包括（但不限于）；肝癌、肺癌、口腔上皮癌、鼻咽癌、甲 状腺癌、食道癌、淋己癌、胸腔癌、消化道癌、膜腺癌、肠癌、乳腺癌、卵巢癌、子宫癌、肾癌、胆 囊癌、胆管癌、中枢神经癌、睾丸癌、膀脫癌、前列腺癌、皮肤癌、黑色素瘤、肉癌、脑癌、血癌、 宫颈癌、胶质瘤、胃癌、或腹水瘤。
[00巧]本发明的第走方面，提供一种药物组合物，包含：
[0056] 第四方面所述的复合物；W及
[0057] 药学上可接受的载体。
[0058] 应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文（如实施例）中具 体描述的各技术特征之间都可W互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在 此不再一一累述。
【附图说明】
[0059] 图 1 为mPEG-SS-LySn-r-HiSm的 1HNMR谱图，其中（A)为mPEG-SS-Lys55 的 谱图；度）为mPEG-SS-Lys95的谱图；（C)为mPEG-SS-Lys55-r-His2。的谱图和值）为 mPEG-SS-Lysg日-r-His2。的谱图。
[0060] 图 2 为mPEG-SS-LyS95-r-HiS2。的透射电镜图。
[0061] 图 3 为mPEG-SS-LySg日-r-Hisz。的水合粒径图。
[0062] 图4为mPEG-SS-Lys55-r-His2。/巧的英光激发波谱。
[0063] 图5为mPEG-SS-Lys95-r-His2。/巧的英光激发波谱。
[0064] 图6为缓冲能力实验结果图。
[0065] 图7为凝胶电泳表征不同质量比的mPEG-SS-Lys"-r-HiSm和pDNA制成的复合 物的复合能力图，其中（A)为mPEG-SS-Lysss/pDNA ;度）为mPEG-SS-Lysss/pDNA ;(C)为 mPEG-SS-Lys日日-r-Hiszn/pDNA和（D)为mPEG-SS-Lysg日-r-Hiszn/pDNA。
[0066] 图8为凝胶电泳表征不同质量比的mPEG-SS-Lys"-r-HiSm和pDNA制成的 复合物的抗面asel降解能力图，其中（A)为mPEG-SS-Lysss-r-Hiszn/pDNA和做为 mPEG-SS-Lysg日-r-Hiszo/pDNA。
[0067] 图9为不同质量比的mPEG-SS-Lys"-r-HiSm和pDNA制成的复合物的平均水合粒径 图。
[0068] 图10为表面电位图。
[0069] 图11为复合体暴露于lOmMG甜不同时长的水合粒径。
[0070] 图12为凝胶电泳表征不同质量比的mPEG-SS-Lys"-r-His2。和siRNA制成的复合物 的复合能力图，其中（A)为mPEG-SS-Lys日日-r-His2〇/siRNA和度）为mPEG-SS-Lysg日-r-His2〇/ siRNAo
[0071] 图13为细胞毒性实验结果图。
[0072] 图14为BCA法测定转染效率结果图。
[0073]图15为FCM法测定转染效率结果图，其中，统计学表述为：卸< =0.05，**p< = 0. 01,林卸<=0. 001,。口〉0. 05。293T细胞组和HepG2细胞组，未标识的两两组之间为***p< =0. 001。MSCs组，未标识的两两组之间为、〉0. 05。
[0074] 图16为血清转染效率结果图，其中星号含义为；**p< = 0. 01，**卸< =0. 001。
[00巧]图17为FCM法检测细胞吞瞻效率结果图，其中，星号含义为：卸< =0.05 ;**p<= 0. 01，***p< = 0. 001。
[0076]图 18 为 293T细胞（A)和胎pG2 细胞做中FITC-mPEG-SS-Lys95-r-HiSm的吞瞻效 率图，其统计学分析结果为各组与对照组相比较而得。其中，星号含义为：卸< =0.〇5，**p< 二 0· 01，本林p〈二 0· 001。
[0077] 图 19 为mPEG-SS-Lysss-r-Hisso/VEGF-siRNA和mPEG-SS-Lys95-r-His2〇/ VEGF-siRNA对化pG2细胞的生长抑制结果图。其统计学分析结果为各浓度梯度下与对照组 相比较而得。其中，星号含义为；林卸< = 0.001。
[0078] 图20为westernblotting实验结果图，其中，（A)为空包对照；度）为阳1/ NC-siRNA;(C)为mPEG-SS-Lys95-r-His2〇/VEGF-si