);巨胞饮途径；渥曼青霉素（100μΜ);
[0178]ATP合成抑制剂；叠氮钢（lOmM);肌动蛋白聚合抑制剂：秋水仙素（40μg/ml)。
[0179] 首先使用FITC标记mPEG-SS-Lysg日和mPEG-SS-Lysg日-r-His2。，具体操作方法如下： 将31. 2mgmPEG-SS-Lys95或mPEG-SS-Lys95-r-His2〇、32mg門TC和400μ1Η己胺混合于 3. 2ml无水DMF中室温下，避光磁力揽拌4她。然后用截留分子量为3500的透析袋避光透 析2d去除过量的FITC，然后冻干，避光保存。
[0180] 收获293T细胞和胎pG2细胞后，W2X104个/孔的密度接种于96孔板内，待细 胞贴壁，增殖至汇合度为60-70 %时，吸弃旧有培养液，沿壁缓慢加入上述溶解于纯DMEM的 抑制剂（200μ1)，置于培养箱预处理30min，然后每孔加入5μg的FITC-mPEG-SS-Lys%或 FITC-mPEG-SS-Lysg日-r-His2。，并继续置于培养箱赔育地。
[0181] 之后，吸弃旧有培养基，用PBS清洗细胞3次，再用0.4%的台盼藍（15μl，2min) 浑灭细胞外的F口C，并用PBS清洗2次，最后用0. 4ml细胞裂解液裂解细胞30min(4°C)。 每孔取0. 2ml裂解液加入全黑96孔板，并用英光酶标仪在在激发波长为485nm，发射波 长为538nm条件下，检测FITC的英光强度。整个涉及FITC的实验操作均在严格避光的 条件下完成。各实验组设计有5个平行样。本实验W未用通道抑制剂作用下，细胞吞瞻 FITC-mPEG-SS-Lys95或FITC-mPEG-SS-Lys95-r-His2。作阴性对照组。
[0182] 由图18可知，与小窝蛋白抑制剂（M-目-CD和染料木素）和巨胞饮抑制剂（渥曼青 霉素）共赔育后，門TC-mPEG-SS-Lysgs的吞瞻效率下降与对照组相比有明显的显著性差异， 而与网格蛋白抑制剂（氯化倭和氯丙嗦）共赔育后，吞瞻效率下降显著性差异较小，说明在 293T细胞中，FITC-mPEG-SS-Lyses主要是通过小窝蛋白途径和巨胞饮途径进入细胞的。在 293T细胞中，FITC-mPEG-SS-Lysg5-r-His2。也主要是通过小窝蛋白途径和巨胞饮途径进入 细胞的。在化pG2细胞中，FITC-mPEG-SS-Lyses主要是通过小窝蛋白途径和巨胞饮途径进 入细胞的；門TC-mPEG-SS-Lysgs-r-Hisw也主要是通过网格蛋白途径和巨胞饮途径进入细 胞的。另外，与ATP合成抑制剂（叠氮钢）和肌动蛋白抑制剂（秋水仙素）共赔育后，在2 种细胞中，FITC-m阳G-SS-Lysgs和FITC-mPEG-SS-Lysg5-r-His2。的吞瞻效率均明显下降，但 没有完全被抑制。推测是体外细胞培养时，培养基中的葡萄糖等成分能继续供给能量。
[0183] 实施例8
[0184] 细胞生长抑制试验
[0185] 通过W上利用祀GFP对mPEG-SS-Lys"-r-HiSm基因递送载体的各种细胞学行为评 价，本实施例继续检测mPEG-SS-Lys"-r-HiSm复合siRNA后，在细胞水平上对细胞的生长抑 制作用W及通过westernblotting实验，在蛋白质水平上检测其作用。空白对照组为未添 加试剂组。阴性对照组选取PEI/NC-siRNA(w/w= 1.3:1)复合物处理组。
[0186] 本实施例选取的可沉默人血管内皮生长因子（VEG巧的siRNA序列及阴性对照序 列均由上海吉玛制药技术有限公司合成。
[0187]VEGF-siRNA：
[0188]正义链；5, -GGAGUACCCUGAUGAGAUCdTdT-3,（沈QIDNO. :1)
[0189]反义链；5, -GAUCUCAUCAGGGUACUCCdTdT-3'（沈QIDNO. :2)
[0190]NC-SiRNA;(阴性对照）
[0191]正义链；5, -UUCUCCGAACGUGUCACGUdTdT-3'（沈QIDNO. :3)
[0192]反义链；5' -ACGUGACACGUUCGGAGAAdTdT-3,（沈QIDNO. :4)
[0193] 具体实验操作为：
[0194] 收获HepG2细胞后，W6X104个/孔的密度接种于24孔板内，待细胞贴壁，增殖至 汇合度为60-70%时，可进行细胞生长抑制实验。首先，参照mPEG-SS-Lys"-r-HiSm/pDNA复 合物转染实验得到的最佳转染比，固定mPEG-SS-Lys"-r-HiSm/siRNA的质量比，W每孔不同 siRNA的质量；0. 5、1、2. 5、5、7. 5μg进行试验。按照实施例3的方法，在100μ1纯DMEM培 养基中制备mPEG-SS-Lys"-r-Hisw/siRNA复合物。赔育30min后，吸弃24孔板内旧有培养 液，沿壁缓慢加入400μ1纯DMEM培养基，然后再均匀点加各复合物，左右轻轻晃匀后，置于 培养箱继续培养地。
[0195] 然后，吸弃含有基因复合物的培养基，并沿壁缓慢加入500μ1全培养基，继续于 培养箱内培养4地。之后用ΜΤΤ法检测细胞生长抑制作用。每孔加50μ1ΜΤΤ，置于培养箱 培养4h后，吸弃旧有培养基，加入1mlDMS0,并在摇床上避光缓慢摇lOmin。每孔取50 1 加入96孔板，再用DMSO稀释2倍后用酶标仪检测其在490nm处的吸光度。用相对存活率 表示细胞生长抑制作用。
[0196]相对存活率％= (ODsample/ODcontrol)X100%
[0197] 其中，ODsample和ODcontrol分别为处理组的3个复孔平均值和空白对照组的3 个复孔平均值。
[0198]从图 19 中可W看出，当VEGF-siRNA的浓度高于 2mg/L时，mPEG-SS-Lysn-r-Hisz。/ VEGF-siRNA即开始能显著抑制HepG2 细胞生长。同时，mPEG-SS-Lysg5-r-His2〇/VEGF-siRNA 复合物对HepG2细胞的生长抑制作用比mPEG-SS-Lys55-r-His2D/VEGF-siRNA复合物强。
[0199] 对于蛋白质水平的评价，本实验采用针对VEGF的westernblotting实验，具体实 验方案如下：
[0200] 选取上述细胞生长抑制实验中的lOmg/L的SiRNA的实验组及空白对照组和阴性 对照组作westernblotting实验。
[0201] 1.细胞中蛋白上清液的制备和浓度测定
[020引A.收集细胞；B.融解RIPA裂解液，混匀。取适当量的裂解液，使用前数分钟内加苯 甲基礙醜氣（PMSF) ;C.按照细胞压积加50μ1裂解液；D.在振荡器上充分震荡数次化充 分裂解细胞后，离必（12000rpm，5min)，取上清；F.使用BCA试剂盒测定BSA标准曲线后，测 定本实验样品的总蛋白浓度。
[0203] 2.灌胶
[0204]A.用蒸傭水清洗灌胶板，竖直瞭干化配制12 %分离胶10ml，加10μ1 Ν，Ν，Ν'，Ν' -四甲基二己胺灯EMED)、100μ110%过硫酸倭混匀后立即灌胶，灌至齿梳下缘 2-3mm，用异丙醇封闭液去除气泡并隔绝空气，室温静置45min待胶完全聚合；C.分离胶 完全聚合后，去除顶部的蒸傭水，滤纸将水吸干；D.配制5%浓缩胶5ml，加5μ1TEMED、 50μ110 %过硫酸倭（APS)，混匀后立即灌胶至顶部，并垂直插入Teflon齿梳，室温静置 20min待胶聚合；E.胶完全聚合后拔出梳子，把凝胶置于电泳槽中，加入电泳缓冲液，用电 泳缓冲液冲洗去除上样孔中的气泡。
[0205] 3.电泳
[0206]A.取各组蛋白提取液，调整蛋白浓度，与等体积2X上样缓冲液混合，即为上样 液化将上样液于l〇〇°C沸水中煮沸5min，使蛋白变性，然后冰上骤冷，离必（30(Κ)巧m， Imin) ;C.每孔加上样液40μg，留一孔加10μ1预染的Marker。加满电泳缓冲液，盖槽盖， 开电源，先用70V恒压电泳，约30min，当漠酪藍指示剂进入分离胶后改用90V恒压电泳，当 漠酪藍到达距凝胶下端约0. 5cm处时关闭电源，取出胶板。
[0207] 4.转印蛋白及免疫检测
[020引 A.在电泳即将结束前，提前将PVDF膜浸泡在甲醇15s，然后用双蒸水漂洗2min，在 转移缓冲液中浸泡5min后开始后续操作化在水中取胶，修整后将胶浸泡在转移缓冲液中 平衡15min;C.按黑面（负极）、海绵、滤纸、胶、PVDF膜、滤纸、海绵、红面（正极）的顺序 制备转膜"H明治"，在每层铺好后，先赶走气泡再铺另一层；D.接通正负极，按膜向正极的 方向，将转移盒放到电转仪中，并加入转膜缓冲液化把电转仪放在冰水中，200mA恒流转 膜70min;F.转膜结束后，迅速取出PVDF膜，放到5%BSA中，室温封闭化；G.取出膜，在摇 床上用TBST洗膜3次，每次5min化赔育袋中加入用封闭液稀释的VEGF-A度osterl:200) 和GAPDH度oster1:2000)，4 °C赔育过夜；I.TBST洗膜3次，每次5min，辣根过氧化物酶 (HR巧标记的羊抗兔二抗（Jacksonl:2000)和辣根过氧化物酶（HR巧标记的羊抗小鼠二抗 (Jacksonl:2000)，室温赔育化；J.TBST洗膜5次，每次15min。将PVDF膜在化学发光检测 试剂（试剂A;试剂B= 1 ;1)反应2min，取出膜后甩去多余的液体，保鲜膜包好PVDF膜，在 暗室中用X胶片感光、显影、定影。
[0209] 由图20可知，mPEG-SS-Lysgs-r-Hiszo/VEGF-siRNA组表现出最明显的抑制VEGF蛋 白质合成的作用，mPEG-SS-Lys55-r-His2〇/VEGF-siRNA组也有较为明显的抑制VEGF蛋白质 合成的作用。而作为阴性对照组没有表现出VEGF蛋白质合成抑制作用。
[0210] 在蛋白质分子水平上，VEGF的表达也远远低于空白对照组和阴性RNA序列 对照组，说明VEGF-siRNA在细胞内有效地进行了转录后调节。送两个实验体现了 mPEG-SS-Lys"-r-His2。在体外能成功地将治疗性的siRNA递送到细胞。
[0211] 综上可知，4种mPEG-SS-Lys"-r-HiSm均具有良好的生物相容性，对细胞的毒副作 用较小，并且均能有效转染上皮细胞、肿瘤细胞和骨髓基质干细胞，尤其是骨髓基质干细胞 中的有效转染为干细胞治疗带来极大的优势。细胞对mPEG-SS-Lys"-r-HiSm基因复合物也 有较好的吞瞻效率，从吞瞻通道结果来看，进步表明mPEG-SS-Lysgs-r-Hisw是一个性能上 比较优越的基因递送载体。mPEG-SS-Lysn-r-Hiszn/VEGF-siRNA复合体在体外能有效的抑 制化pG2细胞的生长，并且能有效地在蛋白质水平上下调VEGF的表达。 邮1引实施例9体内实验
[0213] 9. 1建立肿瘤模型
[0214] 本实验使用的BALB/c裸鼠（4-5周龄，雄）均购自上海斯莱克实验动物有限责任 公司，均饲养在SPF级动物房内。
[0215] 收集活力较强的7X106个化pG2细胞后，用100μΙPBS悬浮，并尽快用5%的水 合氯醒（0.6ml/100g)麻醉裸鼠后，接种于左后肢皮下。7-lOd后，肿瘤可生长至50mm3。 [0引引 9. 2体内分布实验
[0217]首先用B0DIPY英光染料标记mPEG-SS-Lysgs-r-Hisz。基因递送载体；5mgB0DIPY溶于0. 5ml无水DMS0中备用。整个染色过程严格避光。向100μ1溶于碳酸氨钢（lOOmM) 的材料液（Img)中缓慢滴加B0DIPY(按摩尔比为10:1)，室温磁力揽拌反应比。加入0. 1ml 居胺溶液（1. 5M)，室温反应比终止反应，PBS补至0. 5ml(使DMS0含量<10 % )。将反应 液加入超滤管内离必（14000g，20min)弃去外管中的液体，将内管倒置在新的外管中，离必 (lOOOg，2min)，收取溶液（约50μ1)，PB