/1时，3种细胞的存活率均已降至20% 左右。由此说明，4种mPEG-SS-Lys"-r-HiSm聚合物对送3种细胞的毒性远小于阳I。此外， mPEG-SS-Lys日日-r-Hisz。和mPEG-SS-Lysg日-r-Hisz。相比于mPEG-SS-Lys日日和mPEG-SS-Lysgs来 说，其细胞毒性整体上更小。
[0150] 实施例5
[0151] 体外基因转染
[015引将293T细胞、胎pG2细胞和MSCs收获、悬浮后，分别按8X104个/孔、6X104个 /孔和5X104个/孔的密度接种于24孔板。待细胞增殖至一定的汇合度时（293T细胞和 胎pG2细胞：50-60%，MSCs:80-90% )，可进行体外转染操作。
[0153] 制备质量比为1:1到6:1的mPEG-SS-Lysn-r-Hism/祀GFP复合物（按照实施例 2方法，基因报告质粒祀GFP(购自Invitrogen)每孔含量为0. 5ug)，溶剂为100μ1纯 DMEM(293T细胞和HepG2细胞；高糖DMEM，MSCs;低糖DMEM，之后实验均按此对应选用培养 基）。复合物赔育30min后，吸弃孔板内旧有培养基，先沿壁缓慢加入400μ1纯DMEM培养 基，再均匀点加复合物至对应孔中，轻微左右晃匀后置于培养箱，培养地。然后，吸弃含有 基因复合物的培养基，并沿壁缓慢加入500μ1全培养基（含10%胎牛血清和1%PS双抗 的DMEM培养基），继续于培养箱内培养44h。
[0154]BCA蛋白测试方法：吸弃旧有培养基，使用PBS冲洗一遍，加入200μ1细胞裂解 液，于4°C裂解30min。然后取100μ1细胞裂解液加入全黑96孔板，用英光酶标仪在激发 波长为485nm，发射波长为538nm条件下，检测GFP蛋白的英光强度。剩余的100μ1细胞裂 解液离必（200化pmaOmin)沉淀细胞大碎片后，使用BCA试剂盒通过测定BCA标准曲线来 计算总蛋白浓度。最后英光强度W英光强度每毫克蛋白（FluorescentIntensity(A.U.)/ mgofprotein)来表达。各复合物质量比设计有3个平行样。
[01巧]流式细胞仪（FCM)法；收集细胞后，先用500μ1流式缓冲液（含2%FBS和2mM邸ΤΑ的PB巧悬浮细胞，离必后（200化pm, 5min)吸弃上清，再用流式固定液（含2%多聚甲 醒的PB巧固定，送检前避光保存于4°C冰箱。将流式细胞仪检测到表达GFP蛋白的细胞的 百分比作为细胞转染效率。各复合物按BCA蛋白测试方法选取最佳转染效率的质量比进行 本实验，各实验组设计有3个平行样。
[0156] 两种方法均W未处理的细胞作为阴性对照，WPEI(w/w=1. 3:1)作为阳性对照。
[0157] 图14(A)、做和似为通过BCA蛋白浓度测试方法检测的不同质量比的 mPEG-SS-Lys"-r-HiSm/pEGFP分别在293T细胞、胎pG2细胞和MSCs中的转染效率变化。 分析得到，在不同质量比时，各mPEG-SS-Lys"-r-HiSm/pEGFP的转染效率呈现一定的变 化趋势，即存在一个最佳转染效率的质量比。可W归结为；mPEG-SS-Lys55/pEGFP(w/w= 4:l)、mPEG-SS-Lys95/pEGFP(w/w= 5:l)、mPEG-SS-Lys55-r-His2〇/pEGFP(w/w= 3:1)和 mPEG-SS-Lysgs-r-HiS2〇/pEGFP(w/w= 2:1)时，在3种细胞中达到最佳转染效率。另外， 从整体来看，在各mPEG-SS-Lys"-r-HiSm/祀GFP处于最佳转染质量比时，在3种细胞中， mPEG-SS-Lys日日-r-Hiszn/pEGFP和mPEG-SS-Lysg日-r-Hiszn/pEGFP组的转染效率明显高于 mPEG-SS-Lysss/pEGFP和mPEG-SS-Lysgs/pEGFP组，并且其最佳质量比较小。在3种细胞中， 转染效率最佳的是mPEG-SS-Lysgs-r-Hisw/pEGFP组，并且其在各质量比下整体转染效率也 最佳。
[0158]图 15 为用FCM法测得的mPEG-SS-Lysss/pDNA(w/w= 4:1)、mPEG-SS-Lys95/pDNA(w/ w= 5:1) >mPEG-SS-Lys55-r-His2〇/pDNA(w/w= 3:1) >mPEG-SS-Lysg5-r-His2〇/pDNA(w/w= 2:1)和阳I/pDNA(w/w= 1.3:1)在各自最佳转染质量比时，转染常规的293T、胎pG2和 MSC细胞44h后的转染效率，及其两两组之间的统计学比较。从图中可W看出，在293T细 胞中，mPEG-SS-Lysgs-r-Hiszn/pEGFP复合物和阳1/祀GFP复合物的转染效率并无显著性 差异。而在HepG2细胞中，mPEG-SS-Lysg5-r-His2〇/pEGFP复合物转染效率比阳1/祀GFP 复合物仍差一些，但是其显著性差异与BCA法相比，更缩小了一些。最后，在MSCs中， mPEG-SS-Lysgs-r-Hisw/pEGFP复合物的转染效率仍保持领先状态。并且，可W看到另外Η 种mPEG-SS-Lys"-r-HiSm/pEGFP复合物的转染效率与阳1/祀GFP复合相比，其显著性差异均 变小。
[0159]综上，mPEG-SS-Lys"-r-His2〇/pEGFP复合物比mPEG-SS-LysypEGFP复合物的转染 效率要高。另外，在公认的难W转染的MSCs中，mPEG-SS-Lys"-r-His2D/pEGFP复合物具有较 高的转染效率，甚至高于阳性对照组的PEI/祀GFP复合物。
[0160] 为了模拟血液环境，在体外细胞转染时，还进行了含血清细胞转染实验。W293T 细胞和HepG2细胞为模型细胞，各mPEG-SS-Lys"-r-HiSm/pEGFP复合物按BCA蛋白浓度测试 方法选取最佳转染效率的质量比进行本实验，各实验组设计有3个平行样。在添加复合物 作用的44h期间，不再选用纯DMEM培养基，而选用含10 %血清的全培养基。最后用BCA蛋白 测试方法评价血清对复合物细胞转染的影响。其余步骤不改变。WPEI(w/w= 1. 3:1)作为 阳性对照。结果如图 16 所示。mPEG-SS-Lys55/pEGFP(w/w= 4:1)、mPEG-SS-Lys9s/pEGFP(w/ w= 5:l)、mPEG-SS-Lys55-r-His2〇A5EGFP(w/w= 3:l)、mPEG-SS-Lysg5-：r-His2〇A5EGFP(w/w = 2:1)和PEI/pDNA(w/w= 1.3:1)在各自最佳转染质量比时，转染细胞44h后，5种基因递 送系统的转染效率均有所降低。但是，PEI/祀GFP组的转染效率下降最为明显，在293T细 胞和化pG2细胞中分别相差达到3. 8倍和3. 5倍。而在实验组中，mPEG-SS-Lysss/pEGFP、 mPEG-SS-Lysg日/pEGFP、mPEG-SS-Lys日日-r-Hisz。/祀GFP和mPEG-SS-Lysg日-r-Hiszo/pEGFP在 293T细胞和胎pG2细胞中，转染效率相差倍数分别为1.3、1.4、1. 1、1. 1和1.3、1.3、1.2、 1. 1。
[0161] 实施例6
[0162] 细胞吞瞻效率
[0163] 首先按照试剂盒的操作流程对pDNA用红色英光染料作切3标记，具体操作方法如 下：
[0164] 1.取 10μ1pEGFPQ.6μg/μ1)、8μ1Label口Tracker?Regent、 16ullOXUbelingBufferA和 126μ1Sterile&0 依次加入 1.5ml离必管中，用移液枪 吹匀后置于37°C培养箱赔育比。取出离必管，快速离必（13krpm，30s)后，继续于37°C培养 箱赔育Ih。
[016 引 2.依次加入40μlDEPC水、20μlNaCl(过 220nm滤膜，5M)和 400μll00%冰己 醇，封口膜封口后，避光保存于-2(TC化。
[0166] 3.高速低温（230krpm，4°C)离必lOmin，使标记好的质粒成一小球。用移液枪小 必移走所有上清，不可破坏小球。加入0. 5ml70%己醇清洗小球一次，再次高速低温离必，再 次用移液枪小必移走所有上清，待己醇挥发完全，用32μ1无菌&0重悬标记好的质粒。[0167] 4.用核酸浓度测量仪检测标记好的质粒的浓度（468. 8ng/μ1)。
[016引 CLSM法：
[0169] 收获化pG2细胞后，W2X105个/孔的密度接种于6孔板内的盖玻片上，待细胞贴 壁，增殖至汇合度为60-70%时，制备各111?66-55寸7311-尸化3111/祀6。？复合物最佳转染效率 时质量比的复合物（按照实施例2方法，切3-pEGFP每孔含量为2μg)，赔育30min后，吸 弃孔板内旧有培养基，先沿壁缓慢加入1. 5ml纯DMEM培养基，再均匀点加复合物至对应孔 中，轻微左右晃匀后置于培养箱，培养地。然后，在避光条件下进行W下操作：吸弃旧有培 养基，用PBS轻轻冲洗2遍；用4%多聚甲醒室温静置固定lOmin，再用PBS冲洗2遍；滴加 2滴DAPI细胞核英光染液（能湿润细胞即可），室温静置固定lOmin，用PBS冲洗3遍。取 出盖玻片瞭干后，用甘油封片，最后用指甲油固定盖玻片，送检前于4Γ避光暂时保存。
[0170] 检测结果表明，在阳I/pDNA组中，进入细胞核内的pDNA最多。 mPEG-SS-Lys日日-r-His2〇/pDNA和mPEG-SS-Lysg日-r-His2〇/pDNA组中，进入细胞核的pDNA 也较多，并且未进入的细胞核的pDNA也主要集中于核周区域。mPEG-SS-LySss/pDNA和 mPEG-SS-Lysgs/pDNA组中，pDNA更多地停留在细胞质内。总体来说，mPEG-SS-Lysss/ pDNA和mPEG-SS-Lysss/pDNA组细胞摄取的基因复合物比mPEG-SS-Lys55-r-His2〇/pDNA和 mPEG-SS-Lysg日-r-Hiszo/pDNA组少。
[0171] FCM法：
[017引收获HepG2细胞后，W2X105个/孔的密度接种于6孔板内，待细胞贴壁，增殖至 汇合度为60-70%时，制备各111?66-55寸7311-尸化3111/祀6。？复合物最佳转染效率时质量比 的复合物（按照实施例2方法，切3-pEGFP每孔含量为2μg)，赔育30min后，吸弃孔板内旧 有培养基，先沿壁缓慢加入1. 5ml纯DMEM培养基，再均匀点加复合物至对应孔中，轻微左右 晃匀后置于培养箱，培养地。然后按照实施例5中流式细胞仪的制样方法制样，全程应避 光，并尽快送检。各实验组设计有3个平行样。
[0173] 由图17可W看到，阳I/pDNA复合物的细胞吞瞻效率最高，但是， mPEG-SS-Lysgs-r-Hiszn/pDNA复合物和阳I/pDNA复合物的细胞吞瞻效率没有显著性差异。 另外，结合化pG2细胞的转染效率（FCM)和细胞吞瞻效率（FCM)，可W发现，各基因复合体 的细胞吞瞻效率高于转染效率。mPEG-SS-Lys55/pDNA(19.94% ±2. 0,36. 2% ±3. 2,1.8 倍），mPEG-SS-Lys95/pDNA(13.4% ±2. 1，35. 4% ±4. 1，2. 6倍），mPEG-SS-Lys55-r-His2〇/ 口0臟（28.8%±2.0,41.3%±2.1，1.4倍）、111口66-55-1^7395寸-化32〇/口0臟（32.4% ±1.5,48. 1% ±3.0, 1.4倍）和阳I/pDNA(36. 2% ±2. 2,51.9% ±3. 8, 1.4倍）。
[0174] 实施例7
[0175] 细胞吞瞻途径
[0176] 本实验通过采用通道抑制剂抑制各细胞吞瞻途径的方法，检测 mPEG-SS-Lys"-r-HiSm进入细胞的途径。所选用的抑制剂和配制工作浓度如下：
[0177] 网格蛋白途径：氯化倭（50mM)、氯丙嗦（10μg/mU;小窝蛋白途径： M-目-CD(lOmM)、染料木素（200ug/ml