gje l-dong, Seosaemun-gu，首尔，卓?国）。
[0027] 在另一方面，本发明提供了用于生产L-异亮氨酸的方法，所述方法包括培养突变 菌株。
[0028] 具体地，用于生产L-异亮氨酸的方法可进一步包括从突变菌株的培养基回收 L-异亮氨酸。
[0029] 如本文所使用，术语"培养"意为允许微生物在人为控制的合适环境条件下生长。 在本发明中，培养突变谷氨酸棒状杆菌菌株以生产L-异亮氨酸的方法可以使用本领域已 知的任何谷氨酸棒状杆菌培养方法进行。培养方法的实例包括但不限于分批培养、连续 培养和补料分批培养。例如，这些培养方法已经在"Biochemical Engineering"（James M. Lee, Prentice-Hall International Editions, (1991)ppl38_176)中公开。
[0030] 用于培养的方法应当满足特定菌株的需要。用于谷氨酸棒状杆菌的培养基是已 知白勺（例如，Manual of Methods for General Bacteriology. American Society for Bacteriology. Washington D. C.，USA, 1981)〇
[0031] 可以在本发明中使用的碳源可包括糖类和碳水化合物，比如葡萄糖、蔗糖、乳糖、 果糖、麦芽糖、淀粉和纤维素；油脂，比如豆油、葵花油、蓖麻油和椰子油；脂肪酸，比如软脂 酸、硬脂酸和亚油酸；醇，比如甘油和乙醇；和有机酸，比如乙酸。这些物质可以单独使用或 两种或更多种混合使用，但其不限于此。可以在本发明中使用的氮源可包括蛋白胨、酵母提 取物、肉膏、麦芽提取物、玉米浆、脱脂豆饼、和尿素与无机化合物一一比如硫酸铵、氯化铵、 磷酸铵、碳酸铵和硝酸铵。这些氮源也可以单独使用或两种或更多种混合使用，但其不限于 此。可以在本发明中使用的磷源可包括磷酸二氢钾、磷酸氢二钾和相应的含钠的盐。同样， 培养基可进一步包含金属盐，比如硫酸镁或硫酸铁。除上述物质之外，培养基还可包含必需 生长因子，比如氨基酸和维生素。此外，培养基可包含合适的前体。这些物质可以在培养期 间以分批或连续方式添加至培养基。
[0032] 碱性化合物--比如氢氧化钠、氢氧化钾或氨--或酸性化合物--比如磷酸或 硫酸--可以以合适的方式添加至培养基以调节培养基的pH。此外，在培养期间，消泡剂比 如脂肪酸聚乙二醇酯可以用于抑制泡沫的形成。进一步，为了保持培养基处于有氧状态中， 可以将氧气或含氧气体（例如，空气）注入培养基。培养基通常可以保持在20°C至45°C的 温度范围。微生物的培养过程可以持续直到获得期望水平的L-异亮氨酸。为了本发明的 目的，培养周期通常可以为10-100小时。L-异亮氨酸可以释放入培养基或包含在细胞中。 本发明的生产L-异亮氨酸的方法包括从培养基或细胞回收L-异亮氨酸。从培养基或细 胞回收L-异亮氨酸可以使用本领域已知的任何方法进行，例如，离心、过滤、阴离子交换层 析、结晶或HPLC，但不限制于此。在本发明的实例中，低速离心培养基以移除生物质，并且通 过高效液相色谱分离上清液。
[0033] 在一方面，本发明提供了产生用于生产L-异亮氨酸的突变谷氨酸棒状杆菌菌株 的方法，该方法包括从谷氨酸棒状杆菌筛选耐受L-异亮氨酸衍生物和L-苏氨酸衍生物的 突变菌株。
[0034] 亲本菌株谷氨酸棒状杆菌可以是野生型或突变菌株。
[0035] 具体地，突变菌株可以通过诱变方法获得。
[0036] 在本文中，L-异亮氨酸衍生物、L-苏氨酸衍生物和诱变方法如上所述。
[0037] 本发明的产生突变菌株的方法可以通过筛选突变谷氨酸棒状杆菌菌株进行，所述 突变谷氨酸棒状杆菌菌株耐受L-异亮氨酸衍生物和L-苏氨酸衍生物，并且具有以比常规 菌株更高的产量生产L-异亮氨酸的能力。
[0038] 在仍另一方面，本发明提供了突变谷氨酸棒状杆菌菌株KCCM11248P用于生产 L-异壳氨酸的用途。
[0039] 发明实施例
[0040] 在下文中，本发明将参照实施例进一步详细地描述本发明。然而，应当理解的是， 这些实施例用于说明性目的而不意欲限制本发明的范围。
[0041] 实施例1 :通讨人工诱夺筛诜突夺菌株
[0042] 为了获得具有生产L-异亮氨酸的增强能力的突变菌株，以下列方式诱导微生物 中的突变。
[0043] 具体地，亲本菌株谷氨酸棒状杆菌KFCC11040 (韩国专利特开公布号 2000-0002407)在活化培养基（activating medium)中培养16小时，并且将活化的菌株接 种于在121°C灭菌15分钟的种子培养基（seed medium)中。接种的菌株培养14小时，并且 收集5ml的培养基。使用IOOmM柠檬酸缓冲液洗涤收集的培养基，然后向其添加 NTG(N-甲 基-Ν' -硝基-N-亚硝基胍）至200mg/l的终浓度。接着，将培养基放置20分钟，然后使用 IOOmM磷酸盐缓冲液洗涤。将NTG处理的菌株平板接种在基础培养基上，并且结果其杀伤率 测定为85%。为了获得耐受4-硫杂异亮氨酸（thiaile)、异亮氨酸-异羟肟酸（ileHx)和 α-氨基-β-羟基正缬氨酸（AHV)的突变菌株，NTG-处理的菌株平板接种在补充thiaile、 ileHx和AHV至其终浓度分别为ImM、lmg/ml和25mg/ml的基本培养基上。然后，将菌株在 30°C下培养5天，从而获得耐受thiaile、ileHx和AHV的突变菌株。
[0044] 获得的菌株命名为"谷氨酸棒状杆菌，KCJI-38"，并且在2012年1月9日以登录 号KCCMl 1248P保藏于韩国微生物保藏中心。
[0045] 实施例1和2中使用的培养基组分如下。
[0046] 活化培养基
[0047] 1%肉膏，1%聚胨，0.5%氯化钠，1%酵母提取物，2%琼脂，pH 7. 2。
[0048] 种子培养基
[0049] 5%葡萄糖，1 %细菌蛋白胨，0.25%氯化钠，1 %酵母提取物，0.4%尿素，pH 7. 2。
[0050] 基本培养基
[0051] 1.0%葡萄糖，0.4%硫酸铵，0.04%硫酸镁，0· 1 %磷酸二氢钾，0· 1 %尿素， 0· 001 %硫胺素，200 μ g/L生物素，2%琼脂，pH 7. 2。
[0052] 实施例2 :检验产L-异亮氨酸突夺菌株的L-异亮氨酸牛产力
[0053] 为了检验耐受thiaile、ileHx和AHV的在实施例1中获得的突变菌株谷氨酸棒状 杆菌KCJI-38(KCCM11248P)的L-异亮氨酸生产力，以下列方式培养菌株。
[0054] 将亲本菌株和突变菌株的每一种接种在包含25ml的生产培养基（production medium)的250ml三角烧瓶中，然后在30°C下200rpm振荡培养60小时，从而生产L-异亮 氨酸。
[0055] 实施例2中使用的生产培养基组分如下。
[0056] 牛产培养基
[0057] 10 %葡萄糖，0.2 %酵母提取物，1.6 %硫酸铵，0. 1 %磷酸二氢钙，0. 1 %七水硫酸 镁，10mg/l七水硫酸亚铁，10mg/l -水硫酸猛，200 μ g/Ι生物素 ，pH 7. 2。
[0058] 在完成培养之后，通过高效液相色谱分析L-异亮氨酸的生产。L-异亮氨酸在每个 菌株的培养产物中的浓度显不在下面的表1中。
[0059] 表1 :亲本菌株和KCTI_38(KCCM11248P)之间L-异亮氨酸牛产力的比较
[0061] 如上面的表1中可见，亲本菌株谷氨酸棒状杆菌KFCC11040(韩国专利特开公 开号2000-0002407)产生O.lg/Ι的浓度的L-异亮氨酸，而突变菌株谷氨酸棒状杆菌 KCJI-38(KCCM11248P)产生I. 3g/l的浓度的L-异亮氨酸，这表明突变菌株的L-异亮氨酸 生产力比亲本菌株大约高13倍。
[0062] 上述结果表明耐受L-异亮氨酸衍生物和L-苏氨酸衍生物的突变菌株不经受 L-异亮氨的反馈抑制，并且可以被充分地供应作为L-异亮氨酸的前体的L-苏氨酸，这表明 突变菌株可以高效率和高产量地生产L-异亮氨酸。
【主权项】
1. 用于生产L-异亮氨酸的谷氨酸棒状杆菌突变菌株KCCM11248P。2. 根据权利要求1所述的突变菌株KCCM11248P，其中所述突变菌株耐受L-异亮氨酸、 L-苏氨酸、和它们的衍生物。3. 根据权利要求2所述的突变菌株KCCM11248P，其中所述L-异亮氨酸衍生物是4-硫 杂异亮氨酸（thiaile)或异亮氨酸-异羟肟酸（ileHx)，并且所述L-苏氨酸衍生物是α-氨 基-β-羟基正缬氨酸（AHV)。4. 用于生产L-异亮氨酸的方法，包括培养权利要求1-3中任一项所述的突变菌株 KCCM11248P。5. 根据权利要求4所述的方法，进一步包括从所述突变菌株KCCM11248P的培养基回收 L-异亮氨酸。6. 根据权利要求4所述的方法，其中所述培养在有氧条件、20-45°C的温度下进行 10-160 小时。7. 产生用于生产L-异亮氨酸的谷氨酸棒状杆菌突变菌株的方法，所述方法包括筛选 耐受L-异亮氨酸衍生物和L-苏氨酸衍生物的突变菌株。8. 根据权利要求7所述的方法，其中筛选所述突变菌株通过诱变方法进行。
【专利摘要】本发明涉及具有生产L-异亮氨酸的增强能力的微生物和使用该微生物生产L-异亮氨酸的方法。更具体地，本发明涉及谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium？glutamicum)突变菌株，其耐受L-异亮氨酸和L-苏氨酸衍生物并具有生产L-异亮氨酸的增强的能力，并且涉及使用突变菌株生产L-异亮氨酸的方法。KCCM11248P20120109
【IPC分类】C12N1/20, C12P13/06
【公开号】CN105378059
【申请号】CN201380077311
【发明人】金蕙园, 李智惠, 金宗贤, 李翰衡, 全爱智
【申请人】Cj第一制糖株式会社
【公开日】2016年3月2日
【申请日】2013年6月11日
【公告号】CA2915389A1, EP3009504A1, US20160145699, WO2014200126A1