内。
[0035] 减弱和灭活胱硫醚γ合酶活性的方法可按照上述方法进行。
[0036] 如本文所用，术语"高丝氨酸激酶"意指致使高丝氨酸磷酸化的酶，其进行下述化 学反应。在本发明中，来自大肠杆菌的高丝氨酸激酶被命名为" ThrB "。
[0037] ATP+L-高丝氨酸一ADP+0-磷酸-L-高丝氨酸
[0038] 具体地，来自埃希氏菌属的高丝氨酸激酶一一虽然并非具体限于此一一可以是包 括SEQ ID NO: 11表示的氨基酸序列或与SEQ ID NO: 11的氨基酸序列具有70%或更高、具 体地80%或更高、或更具体地90 %或更高同源性的氨基酸序列的蛋白质。另外，作为具有 同源性的序列，如果该氨基酸序列是与SEQ ID NO :11的氨基酸序列具有相同或相应高丝氨 酸激酶活性的氨基酸序列，则在部分序列具有敲除、修饰、替换、或添加的氨基酸序列显然 也应被包括在本发明的范围内。另外，基于遗传密码简并，编码相同氨基酸序列和其变体的 多核苷酸序列也应被包括在本发明的范围内。
[0039] 减弱和灭活高丝氨酸激酶活性的方法可按照上述方法进行。
[0040] 在本发明的具体方面，微生物可以是这样的微生物：其中高丝氨酸0-乙酰基转移 酶的活性被进一步引入或增强，或内源高丝氨酸0-琥珀酰基转移酶被进一步修饰以具有 高丝氨酸0-乙酰基转移酶的活性。
[0041] 如本文所用，术语"高丝氨酸ο-乙酰基转移酶（EC 2. 3. 1. 31) "意指具有将乙酰基 从乙酰辅酶A转移至高丝氨酸的活性的酶。
[0042] 具体地，可将高丝氨酸0-乙酰基转移酶活性引入根据本发明的微生物。高丝 氨酸O-乙酰基转移酶可源自各种微生物物种，例如，选自下列的微生物：棒状杆菌属、钩 端螺旋体属、奇异球菌属（Deinococcus sp.)、奇异球菌属、假单胞菌属、和分支杆菌属 (Mycobacterium sp.)。具体地，高丝氨酸0-乙酰基转移酶可以是包括下列表示的氨基酸序 列的高丝氨酸O-乙酰基转移酶：SEQ ID NO: 13 (迈氏钩端螺旋体（Leptospira meyeri))、 SEQIDN0:14(谷氨酸棒状杆菌（Corynebacteriumglutamicum))、或SEQIDN0:15(抗福 射奇异球菌（Deinococcus radiodurans))，但不限于此。另外，高丝氨酸O-乙酰基转移酶 可以是包括上述氨基酸序列或与上述氨基酸序列具有70%或更高、具体地80%或更高、或 更具体地90%或更高同源性的氨基酸序列的蛋白质。另外，基于遗传密码简并，编码相同氨 基酸序列和其变体的多核苷酸序列也应被包括在本发明的范围内。
[0043] 本发明所用的高丝氨酸0-乙酰基转移酶的实例被公开于韩国专利申请公开号 10-2011-0023703和欧洲专利申请公开号EP 2290051，这些专利文件的完整说明书可被本 发明包括作为参考。
[0044] 另外，其中内源高丝氨酸0-琥珀酰基转移酶（EC 2. 3. 1. 46)经修饰具有高丝氨酸 0-乙酰基转移酶活性的蛋白质意指这样的多肽：其中具有高丝氨酸0-琥珀酰基转移酶活 性的多肽的底物特异性从琥珀酰辅酶A变成乙酰辅酶A。另外，修饰蛋白质一一虽然并非具 体限于此一一可以是通过替换具有高丝氨酸〇-琥珀酰基转移酶活性的多肽的部分氨基酸 序列而不同于其野生型的具有高丝氨酸〇-乙酰基转移酶活性的肽。
[0045] 高丝氨酸0-琥泊酰基转移酶的实例可以是来自肠细菌属（Enterobacteria sp.)、沙门氏菌属、假单胞菌属、杆菌属（Bacillus sp.)、或埃希氏菌属的多肽，具体地、来 自埃希氏菌属的具有高丝氨酸0-琥珀酰基转移酶活性的多肽，例如，来自大肠杆菌的具有 高丝氨酸0-琥珀酰基转移酶活性的多肽。更具体地，来自大肠杆菌的高丝氨酸0-琥珀酰 基转移酶可具有SEQ ID NO :16表示的氨基酸序列，但不限于此。来自大肠杆菌的高丝氨酸 0-琥珀酰基转移酶被命名为"MetA"。
[0046] 修饰型高丝氨酸0-琥珀酰基转移酶可以是变体多肽，其中SEQ ID NO :16表示的 多肽或与SEQ ID NO :16的多核苷酸序列具有95%或以上同源性的多肽的第111位氨基酸 被谷氨酸取代，另外，第112位氨基酸被苏氨酸或组氨酸取代。具体地，变体多肽可以是具 有SEQ ID NOS :17至19中任一个的氨基酸序列的多肽。另外，变体多肽可以是包括与上述 氨基酸序列具有70 %或更高、具体地80 %或更高、或更具体地90 %或更高同源性的氨基酸 序列的蛋白质。另外，基于遗传密码简并，编码相同氨基酸序列和其变体的多核苷酸序列也 应被包括在本发明的范围内。关于修饰型高丝氨酸〇-琥珀酰基转移酶的信息可从韩国专 利申请公开号10-2012-0070531或国际公开号W02012/087039获得，这些专利文件的完整 说明书被本发明包括作为参考。
[0047] 如本文所用，术语"引入或增强活性"意指提供具体蛋白质的活性给不具有该蛋白 质的微生物；或在具有该蛋白质的微生物内增强该蛋白质的胞内活性，和类似情况，并且意 指与该蛋白质的内源活性相比增加该蛋白质的胞内活性。
[0048] 如本文所用，术语"引入或增强蛋白质活性"不仅意指由于增加蛋白质自身活性而 导致实现效果高于原始功能，而且意指由于内源基因活性增加、内部或外部因素造成的内 源基因扩增、拷贝数增加、从外界引入基因、因替换、修饰或突变造成的酶活性增加等导致 的蛋白质活性增加，但不限于此。
[0049] 在上文中，基因拷贝数增加一一虽然并非具体限于此一一可在可操作地连接至载 体的状态下进行、或通过插入宿主细胞中的染色体进行。具体地，该方法可通过如下进行： 将可操作地连接编码本发明蛋白质的多核苷酸并且可独立于宿主进行复制和发挥功能的 载体引入宿主细胞；或将可操作地连接多核苷酸、使该多核苷酸插入宿主细胞染色体的载 体引入宿主细胞，从而增加在宿主细胞染色体内的基因拷贝数。
[0050] 载体是这样的DNA构建物：包括编码目标蛋白质的多核苷酸的多核苷酸序列，其 可操作地连接至适当的调控序列，以使目标蛋白质可在合适的宿主中表达，其中调控序列 包括启动转录的启动子、调控转录的无规操纵子序列、编码适当的mRNA核糖体结合域的序 列、和调控转录和翻译的序列。载体在转化到适当的宿主细胞后可独立于宿主基因组进行 复制或发挥功能，或可被整合到宿主基因组自身中。
[0051] 本发明使用的载体可不被具体限制，只要该载体在宿主细胞中可复制，并且可使 用本领域已知的任何载体。载体的实例可包括天然或重组质粒、粘粒、病毒、和噬菌体。例 如，作为噬菌体载体或粘粒载体，可使用pWE15、M13、XMBL3、XMBL4、λΙΧΙΙ、AASHII、 λ ΑΡΙΙ、λ tlO、λ til、Charon4A、Charon21A、等；和作为质粒载体，可使用 pBR 系、pUC 系、 pBluescriptll 系、pGEM 系、pTZ 系、pCL 系、pET 系等。具体地，可使用 pDZ、pACYC177、 pACYC184、pCL、pECCG117、pUC19、pBR322、pMW118、pCCIBAC 载体等。
[0052] 另外，可利用插入微生物染色体的载体用修饰多核苷酸取代编码内源目标蛋白质 的多核苷酸。多核苷酸插入染色体可利用本领域已知的方法进行，例如，通过同源重组。由 于本发明的载体可通过同源重组插入染色体，可另外包括用于证实插入染色体的选择标记 物。利用选择标记物来选择被转化的细胞，即，证实目标多核苷酸是否已被插入，并且可使 用提供可选表型如抗药性、营养需求、细胞毒剂抗性、和表面蛋白质表达的标记物，但不限 于此。在选择剂处理的情况下，只有表达选择标记物的细胞可存活或表达其他表型特征，因 此可容易选择被转化的细胞。
[0053] 如本文所用，术语"转化"意指将包括编码目标蛋白质的多核苷酸的载体引入宿主 细胞，从而实现编码蛋白质的多核苷酸在宿主细胞中表达的过程。关于转化的多核苷酸，其 是被插入宿主细胞的染色体并位于其中还是位于染色体外无关紧要，只要其可在宿主细胞 中表达即可。另外，多核苷酸包括编码目标蛋白质的DNA和RNA。多核苷酸可以任何方式插 入，只要其可被引入宿主细胞并且在其中表达。例如，多核苷酸可以表达盒形式被引入宿主 细胞，表达盒是包括自我表达所需的所有必需要素的基因构建物。表达盒可常规地包括可 操作地连接至多核苷酸的启动子、转录终止信号、核糖体结合域、和翻译终止信号，并且可 以是能够自我复制的表达载体形式。另外，多核苷酸可被原样引入宿主细胞，并且可操作地 连接至其在宿主细胞中表达所必需的序列。另外，如本文所用，术语"可操作地连接"意指 启动子序列（启动和介导编码目标蛋白质的多核苷酸的转录）和基因序列之间的功能性连 接。
[0054] 然后，可通过如下进行表达调控序列的修饰一一虽然并非具体限于此一一以增加 多核苷酸表达：经由敲除、插入、保守型替换、非保守型替换、或其组合诱导多核苷酸序列改 变，以进一步增强表达调控序列的活性；或用活性较强的多核苷酸序列替换多核苷酸序列。 表达调控序列一一虽然并非具体限于此一一可包括启动子、操纵子序列、编码核糖体结合 域的序列、和调控转录和翻译终止的序列等。另外，强外源启动子，代替原启动子，可被连接 至多核苷酸表达单元的上端。
[0055] 此外，可通过如下进行染色体上多核苷酸序列的修饰一一虽然并非具体限于此： 经由敲除、插入、保守型替换、非保守型替换、或其组合诱导多核苷酸序列的表达调控序列 改变，以进一步增强多核苷酸序列的活性；或用活性较强的增强型多核苷酸序列替换多核 苷酸序列。
[0056] 总体上，蛋白质活性的引入和增强可使相应蛋白质的活性或强度相对于野生型 蛋白质或微生物中的蛋白质的活性或强度增加至少1%、1〇%、25%、50%、75%、100%、 150%、200%、300%、400%、或 500%，至多 1000%或 2000%。
[0057] 另外，微生物可以是这样的微生物：其中内源高丝氨酸0-琥珀酰基转移酶的活性 与内源活性相比减弱或灭活，从而通过阻断由高丝氨酸生物合成〇-琥珀酰基高丝氨酸的 途径来增强〇-乙酰基高丝氨酸的生物合成途径。
[0058] 高丝氨酸0-琥珀酰基转移酶活性的减弱和灭活可按照上述方法进行。
[0059] 在本发明的示例性实施方式中，0-乙酰基高丝氨酸生产微生物可这样的微生物： 其中从磷酸稀醇丙酮酸盐（phosphoenolpyruvate)至高丝氨酸的生物合成途径所涉及的 酶的活性被另外引入或增强，以进一步增加高丝氨酸（〇-乙酰基高丝氨酸生物合成的底 物）的量。
[0060] 具体地，上述微生物可以是这样的微生物：其中选自磷酸烯醇丙酮酸羧化酶 (ppc，EC 4. I. L 31)、天冬氨酸氨基转移酶（aspC，EC 2.6. L 1)、和天冬氨酸半醛脱氢酶 (asd，EC 1. 2. 1. 11)的至少一种蛋白质的活性被进一步引入或增强。
[0061] 例如，编码包括SEQ ID NO :20表示的氨基酸序列的羧酸磷酸烯醇丙酮酸的ppc基 因、编码包括SEQ ID NO :21表示的氨基酸序列的天冬氨酸氨基转移酶的aspC基因、和编码 包括SEQ ID NO :22表示的氨基酸的天冬氨酸半醛脱氢酶的asd基因可被引入微生物。例 如，这三种不同酶的活性可通过如下被引入和增强：使存在于宿主细胞染色体中的编码这 三种不同酶的基因的拷贝数全部至少为2,但不限于此。活性的引入和增强可按照上述方法 进行。
[0062] 在本发明的示例性实施方式中，通过各种方法减弱或灭活柠檬酸合酶蛋白的活 性，包括敲除生产〇-乙酰基高丝氨酸的大肠杆菌微生物中的柠檬酸合酶基因；将编码与野 生型相比活性减弱的修饰柠檬酸合酶蛋白的基因引入柠檬酸合酶基因的位置；和引入柠檬 酸合酶基因反义RNA的表达载体。结果是，由此构建的柠檬酸合酶蛋白活性减弱或灭活的 0-