乙酰基高丝氨酸生产微生物，与亲本微生物相比，显示出提高的0-乙酰基高丝氨酸生产 能力（实施例1至4)。
[0063] 另一方面，本发明提供利用0-乙酰基高丝氨酸生产能力提高的0-乙酰基高丝氨 酸生产微生物生产O-乙酰基高丝氨酸的方法。具体地，本发明提供生产O-乙酰基高丝氨 酸的方法，包括（a)培养微生物；和（b)回收在微生物培养期间生产的0-乙酰基高丝氨酸。 [0064] 根据本发明所述的具有0-乙酰基高丝氨酸生产能力的大肠杆菌的培养方法可按 照本领域已知的适当培养基和培养条件进行。本领域技术人员可容易根据所选微生物调整 培养过程。具体地，由于本发明的微生物是柠檬酸合酶（介导TCA循环第一步的酶）的活 性减弱或灭活的微生物，培养基可包括谷氨酸盐，但不具体限于此。
[0065] 培养方法的实例可包括分批培养、连续培养、和补料分批培养，但不限于此。这 些不同的方法例如被公开于〃Biochemical Engineering", James M. Lee, Prentice-Hall International Editions,第 138-176 页中。
[0066] 培养中使用的培养基可适当地满足具体微生物的要求。具体地，微生物培养基的 实例被公开于〃Manual of Methods for General Bacteriology"，American Society for Bacteriology, Washington, DC, 1981。培养基可以是包括合适的碳源、磷源、无机化合物、氨 基酸、和/或维生素等的培养基，并且培养可在有氧条件下同时调节温度、PH等进行。
[0067] 碳源的实例可包括碳水化合物，如葡萄糖、乳糖、鹿糖、乳酸、果糖、麦芽糖、淀粉、 和纤维素；脂肪，如大豆油、葵花籽油、蓖麻油、berber oil、和椰子油；脂肪酸，如棕榈酸、硬 脂酸、和亚油酸；醇，如丙三醇和乙醇；和有机酸，如乙酸。这些碳源可单独或组合使用，但 不限于此。
[0068] 氮源的实例可包括有机氮源，如蛋白胨、酵母提取物、肉汤、麦芽提取物、玉米浆 (CSL)、和豆粉；和无机氮源，如尿素、硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、碳酸铵、和硝酸铵。这些氮源 可单独或组合使用、但不限于此。培养基可进一步包括磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、和相应的 含钠盐作为磷源。培养基可包括金属，如硫酸镁和硫酸铁。另外，可包括氨基酸、维生素和 合适的前体。这些培养基或前体可以分批培养或连续培养的形式加入培养物中，但不限于 此。
[0069] 另外，可在培养期间以合适的方式通过添加化合物如氢氧化铵、氢氧化钾、氨、磷 酸、和硫酸调节培养物的pH。另外，可利用消泡剂如脂肪酸聚二醇酯在培养期间防止泡沫 形成。另外，为维持培养液的有氧条件，可添加氧气或包含氧气的气体（例如，空气）至培 养物。培养温度可以为20°C至45°C，具体地25°C至40°C，但不限于此。培养可持续，直到 0-乙酰基高丝氨酸的生产达到目标水平，具体地持续10小时至160小时，但不限于此。
[0070] 本发明的生产0-乙酰基高丝氨酸的方法可进一步包括从培养的微生物或其培养 产物回收O-乙酰基高丝氨酸。目标O-乙酰基高丝氨酸的回收可通过根据本发明所述的 微生物培养方法进行，例如，本领域已知的适当方法，如分批培养、连续培养、和补料分批培 养。
[0071] 回收可包括纯化步骤。
[0072] 由此回收的0-乙酰基高丝氨酸可通过两步法（韩国专利号10-0905381)生产甲 硫氨酸。
[0073] 两步法包括通过利用具有0-乙酰基高丝氨酸硫化氢解酶活性的酶或具有这种酶 的微生物的酶反应，同时利用L-甲硫氨酸前体生产微生物生产的0-乙酰基高丝氨酸和甲 硫醇作为底物生产L-甲硫氨酸和有机酸的过程。
[0074] 更具体地，本发明提供通过0-乙酰基高丝氨酸硫化氢解酶等的酶反应，利用通过 上述方法积累的〇-乙酰基高丝氨酸作为底物生产L-甲硫氨酸的方法。
[0075] 在第二步中，当0-乙酰基高丝氨酸用作L-甲硫氨酸前体时，可使用源自微生物的 〇-乙酰基高丝氨酸硫化氢解酶，该微生物具体地属于钩端螺旋体属、色杆菌属、和生丝单胞 菌属（Hyphomonas sp.)，更具体地属于迈氏钩端螺旋体（Leptospira meyeri}_、铜绿色假单 胞菌（Pseudomonas aurogenosa)、海王生丝单胞菌（Hyphomonas Neptunium)、和紫色色杆 菌（Chromobacterium Violaceum)〇
[0076] 反应同下文显示。
[0077] CH3SH +O-乙酰基-L-高丝氨酸η乙酸盐十甲硫氨酸
[0078] 生产甲硫氨酸的另外过程被公开于韩国专利号10-0905381中，该专利的整个说 明书可作为引用被本发明包括。
[0079] 用于发明的方式
[0080] 下文参考下列实施例对本发明进行更详细的描述。然而，这些实施例仅以示例为 目的，并非意图本发明受限于这些实施例。
[0081] 参考实施例：构律〇-乙酰基高丝氨酸牛产微牛物
[0082] 〈1_1>敲除源自野生型大肠杆菌的metB基因（国际公开号WO 2008/013432)
[0083] 利用大肠杆菌（埃希氏菌属的代表性微生物）构建0-乙酰基高丝氨酸生产微生 物。为此，使用从美国菌种保藏中心（American Type Culture Collection，ATCC)获得的 野生型大肠杆菌K12W3110 (ATCC27325)。首先，为阻断0-琥珀酰基-L-高丝氨酸至胱硫醚 的合成途径，敲除编码胱硫醚合酶的metB基因 （SEQ ID NO: 10)。具体地，通过FRT--步 PCR敲除法（PNAS (2000) vol 97 :P6640-6645)敲除编码胱硫醚合酶的metB基因。
[0084] 具体地，利用 SEQ ID NOS :30 和 31 的引物，基于 pKD3 载体（PNAS (2000) vol 97 : P6640-6645)作为模板，通过PCR反应，如下构建metB缺失盒：94°C变性30秒，55°C退火30 秒，和72°C延伸1分钟，30个循环。将所得PCR产物在1. 0%琼脂糖凝胶上进行电泳，并纯 化由此获得的I. 2kb DNA带。将回收的DNA片段电穿孔到已被pKD46载体转化的大肠杆菌 (K12)W3110(PNAS(2000)vol 97 :P6640-6645)中。关于电穿孔，将 pKD46 转化的 W3110 菌株 在30°C下在包含100 μ g/L氨苄西林和5mM阿拉伯糖（L-阿拉伯糖）的LB培养基中培养， 直到0D6。。= 0. 6,并在用无菌蒸馏水洗涤两次和用10%丙三醇洗涤一次后使用。电穿孔在 2500V下进行。将回收的菌株在包含25yg/L氯霉素的LB平板上划线（streak)，在37°C下 培养过夜，并选择显示抗性的菌株。使选择的菌株在相同条件下，利用相同引物，基于该菌 株作为模板，进行PCR反应，并通过观察1. 0%琼脂糖凝胶上I. 2kb的基因尺寸来证实metB 基因的敲除。将由此证实的菌株在经PCP20载体（PNAS(2000)vol 97 :P6640-6645)再次转 化后在LB培养基中培养，并构建最终的metB基因敲除菌株（其中通过相同条件下进行的 PCR，在1. 0%琼脂糖凝胶上，基因尺寸减少至150bp)，并证实氯霉素标记物的去除。由此构 建的菌株被命名为"W3-B"。
[0085] 〈1-2> 敲除 thrB 基因（国际公开号 WO 2008/013432)
[0086] 在增加来源于高丝氨酸的0-琥珀酰基高丝氨酸合成量的工作中，敲除thrB基 因一一高丝氨酸激酶编码基因。关于从实施例1构建的W3-B菌株敲除thrB基因，采用敲 除metB基因时使用的FRT -步PCR敲除法。
[0087] 利用 SEQ ID NOS :32 和 33 的引物，基于 pKD4 载体（PNAS(2000) vol 97 : P6640-6645)作为模板，通过PCR，如下构建thrB缺失盒：94°C变性30秒，55°C退火30秒， 和72 °C延伸1分钟，30个循环。
[0088] 将所得PCR产物在1. 0%琼脂糖凝胶上进行电泳，并纯化由此获得的I. 6kb DNA 带。将回收的DNA片段电穿孔到已被pKD46载体转化的W3-B菌株中。将回收的菌株在包 含50 μ g/L卡那霉素的LB平板上划线，在37°C下培养过夜，并选择显示抗性的菌株。
[0089] 将选择的菌株利用相同的SEQ ID NOS :32和33的引物，直接基于该菌株作为模 板，在相同条件下进行PCR反应，并通过选择在I. 0%琼脂糖凝胶上具有I. 6kb基因尺寸的 菌株来证实thrB基因的敲除。将由此证实的菌株经pCP20载体再次转化后在LB培养基中 培养，并构建最终的thrB基因敲除菌株（其中通过相同条件下进行的PCR，在1.0%琼脂糖 凝胶上，基因尺寸减少至150bp)，并证实卡那霉素标记物的去除。由此构建的菌株被命名为 "W3-BT"。
[0090] 〈1-3>具有高丝氨酸乙酰基转移酶活性的变体metA (国际公开号WO 2012/087039)
[0091] 为强化参考实施例〈1_2>获得的菌株的高丝氨酸乙酰基转移酶活性，意图引入编 码高丝氨酸乙酰基转移酶的突变型metA基因 （SEQ ID NOS :24和26)。
[0092] 首先，为构建活性强化的metA基因变体，利用SEQ ID NOS :34和35的引物，基于 野生型菌株W3110的染色体作为模板，进行PCR反应，扩增编码高丝氨酸0-琥珀酰基转移 酶的metA基因。
[0093] 基于在NIH基因库登记的大肠杆菌染色体NC_000913的多核苷酸序列来制备PCR 反应中使用的引物，并且SEQ ID NOS :34和35的引物分别具有EcoRV和HindIII限制位 点。将由此获得的PCR产物和包括Pcj 1的pCL1920质粒分别用EcoRV和HindIII处理， 并将PCR产物克隆到pCL1920质粒中。用克隆质粒转化大肠杆菌DH5 α，并在包含50 μ g/ mL大观霉素的LB平板上选择转化的大肠杆菌DH5 α，从中获得质粒。由此获得的质粒被命 名为 "pCL_Pcjl_metA"。
[0094] 然后，利用定点诱变试剂盒（Strata基因，USA)，基于以上构建的pCL_Pcjl_metA 质粒作为模板，用谷氨酸（Glu) (GlllE)取代0-琥珀酰基转移酶的第111位氨基酸，甘氨酸 (Gly)。由此构建的包括GlllE metA基因变体的质粒被命名为"pCL_PCjl_metA(EL) "。
[0095] 另外，为进行0-琥珀酰基转移酶的第111位氨基酸从甘氨酸至谷氨酸取代，和第 112位氨基酸从亮氨酸至组氨酸取代，使用SEQ ID NOS :38和39的引物。包括其中第111 位氨基酸从甘氨酸至谷氨酸取代并且第112位氨基酸从亮氨酸至组氨酸取代的metA基因 的质粒被命名为"pCL_Pcj IjnetA (EH) "。
[0096] 然后，利用pKD3载体作为模板以及SEQ ID NOS :40和41的引物，通过PCR，如下 构建用于将1^七4伍!1)替换到菌株中的替换盒：94°(：变性30秒，55°(：退火30秒，和72°(：延 伸2分钟，30个循环。利用PCL-PcjlnetA(EH)作为替换盒metA (EH)部分的模板以及SEQ ID NOS :42和43的引物、和野生型metA部分的SEQ ID NOS :42和45的引物，获得各个PCR 产物。利用三种不同PCR产物以及SEQ ID NOS :42和45的引物，构建包括氯霉素标记物 部分的metA (EH)替换盒，并将其电穿孔到参考实施例〈1-2>构建的已被pKD46载体转化的 W3-BT菌株中。将由