032] 抗黄曲霉毒素单域重链抗体的淘选与鉴定
[0033] 采用固相亲和淘选的方法从实施例1所得抗黄曲霉毒素单域重链抗体免疫文库 文库中淘选针对黄曲霉毒素的单域重链抗体。将AFB 1与卵清白蛋白（albumin，0VA)共价 偶联，得到人工抗原AFB「0VA。每孔加入100 μ L用PBS稀释的人工抗原AFB「0VA，4°C，包 被过夜，每轮淘选的包被浓度分别为100, 75, 50 μ g/mL ;吸出包被液，PBS洗板3次，每孔加 入300 μ L 3% BSA-PBS，37°C，封闭2h ;PBS洗板6次，加入100 μ L噬菌体抗体文库（约含 2Χ IO11CFU)，37°C，孵育I. 5h ;吸出未结合的噬菌体，用PBST(含0. 5% Tween-20)洗板5次 (逐轮增加5次），再用PBS洗板10次（洗板次数逐轮增加5次）；以100 μ L洗脱液（甘氨 酸-盐酸，ΡΗ2. 2)洗脱吸附在酶标孔中的噬菌体，用50 μ L Tris-HCl (lmol/L，pH 8. 0)中 和洗脱物，取10 μ L用于滴度测定，其余洗脱物扩增后用于下一轮淘选。第二轮和第三轮淘 选采用竞争洗脱，分别用50和25ng/mL的AFB1溶液在37°C，孵育lh。
[0034] 经三轮淘选后，采用辅助噬菌体KM13对随机挑取的单克隆进行救援，分别得到展 示抗体可变区的菌体颗粒，再用间接phage-ELISA和间接竞争phage-ELISA测定菌体 颗粒的结合活性和特异性，实验设定阴性对照及背景对照，具体加样步骤见表2。
[0035] 表2间接phage-ELISA加样表
[0037] 将ELISA阳性克隆送生物技术服务公司进行序列测定，得到插入片段的DNA序列， 其编码针对黄曲霉毒素的单域重链抗体，具体如下（SEQ ID NO. :2):
[0038] CAGGTGCAGCTCGTGGAGTAGGGGGGAGGCTTGGTGCAGCCTGGGGGGTCTCTGAGACTCTCCTGTACA GCCTCTGGAAGCATCTATAGCCTCGTTGCCATGGGCTGGTACCGCCAGGCTCCAGGGAAGCAGCGCGAGTGGGTCGC AGATATTACTCGTGTTGGTAACACAAACCATGCGAACTCCAGGGAGGACCGATTCACCATCTCGACAGGTGTCCCCT GGAACACGGTGATTCTGTCTATGAACAGCCTGGAACCTGAGGACACGGCCGTCTATTACTGTGCAGCACGTCGGACG CTCTCACGGGTACTTGGCACGAAGAGAGATGAGTATAACTACTGGGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCTCA
[0039] 依据DNA测序结果及密码子表可获得针对黄曲霉毒素的单域重链抗体的氨基酸 序列（SEQ ID Nd : 1):
[0040] QVQLVENGGGLVQPGGSLRLSCTASGSIYSLVAMGWYRQAPGKQREWVADITRVGNTNHANSREDRFTI STGVPWNTVILSMNSLEPEDTAVYYCAARRTLSRVLGTKRDEYNYWGQGTQVTVSS
[0041] 采用间接竞争phage-ELI SA法对阳性克隆与几种不同黄曲霉毒素亚型的交叉 反应率进行测定，将AFB^ AFB2、AFG^ AFGjP AFM i五种标准品稀释至12个不同的工作浓 度，在同样的条件下进行间接竞争phage-ELISA测定，分别绘制竞争ELISA曲线，计算抑 制率为50%时的标准品浓度（IC 5。)，按照公式：交叉反应率（％) = (AFBi IC5。/类似物 IC5。）X 100%，所述类似物为AFB2、AFGp AFG2S AFM i，得到本发明阳性克隆（针对黄曲霉毒 素的单域重链抗体）对于AFBj^ 50%抑制浓度。结果表明，本发明阳性克隆（针对黄曲霉 毒素的单域重链抗体）对于AFB1具有较好的特异性，对AFG JP AFG 2也有一定的结合能力。
[0042] 实施例3 :
[0043] 抗黄曲霉毒素单域重链抗体的规模制备
[0044] 编码抗AFB^域重链抗体的DNA片段的获取：1.采用限制性内切酶Sfil/Notl， 双酶切噬菌粒PHEN-抗AFB 1单域重链抗体基因，琼脂糖凝胶电泳回收抗AFB i单域重链抗体 基因；2.直接将抗AFB1单域重链抗体编码序列送生物技术服务公司进行化学合成；3.设计 特异性引物，通过PCR技术从羊驼（Lama pacos)来源的cDNA库中扩增。
[0045] 将得到的抗AFB1单域重链抗体基因片段克隆至表达载体pET25,经PCR和酶切鉴 定，构建完成抗六?8 1单域重链抗体的大肠杆菌表达质粒。
[0046] 将表达质粒转化至大肠杆菌BL21，挑取单菌落进行诱导表达。将单菌落接入4mL LBA(Luria-Bertani broth with 100yg/mL ampicillin)液体培养基中，37°C、250r/min 振荡培养12h ;以I %培养基体积的接种量将其转接到50mL LBA液体培养基中，37°C、250r/ min振荡培养至OD6。。达到0· 5 (约需2· 5~3h)，加入终浓度0· ImM的IPTG，30°C、200r/min 诱导培养。
[0047] 诱导培养物8000r/min离心，在细胞沉淀中加入20mL磷酸缓冲液（pH 7. 4)混匀， 8000r/min离心，去上清，保留细胞沉淀；在细胞沉淀中加入IOmL相同缓冲液，混勾，冰上超 声波细胞破碎处理，超声破碎条件为200W，破碎2s，间歇3s，共240个循环，在4°C下对细胞 破碎物12000r/min离心20min，取上清进行亲和层析纯化和SDS-PAGE电泳分析，或在上清 中加入终浓度30 %的甘油，混匀，保存于-20 °C冰柜待用。
[0048] 通过优化诱导表达条件（如宿主菌、表达载体、诱导培养时间、温度以及IPTG浓度 等），可以进一步提高目的蛋白（单域重链抗体）表达量，为大量制备抗AFB 1单域重链抗体 提供了途径。
[0049] 实施例4 :
[0050] 抗黄曲霉毒素单域重链抗体的融合表达
[0051 ] 将本发明抗AFB1单域重链抗体基因克隆至融合表达载体pAP，经PCR和酶切鉴定， 构建完成抗六?81单域重链抗体的碱性磷酸酶融合表达质粒。
[0052] 碱性磷酸酶可以非特异性催化磷酸单酯水解生成无机磷酸和相应的醇、酚或糖类 化合物。该酶常作为信号标签用于ELISA、免疫印迹、组织化学等检测方法。融合表达质粒 将抗AFB 1单域重链抗体融合于碱性磷酸酶的N端，参考应用实例2中的表达方法，可以在 大肠杆菌中表达、纯化出融合蛋白AP-抗AFB 1单域重链抗体基因。
[0053] 实施例5 :
[0054] 抗黄曲霉毒素单域重链抗体用于黄曲霉毒素 B1的检测
[0055] 样品准备：称取不含黄曲霉毒素的花生、玉米样品各三份，分别加入AFB1标准品 10 μ g/kg, 50 μ g/kg, 100 μ g/kg，用 25mL 60%的甲醇-PBS溶液祸旋振荡 15min，9000g离心 lOmin，上清经PBS稀释后待用。
[0056] 间接竞争酶联免疫检测：
[0057] 用 PBS (0. 01M，pH 7. 4)将 AFB1A工抗原稀释至 0. 25 μ g/mL，100 μ L/ 孔，包被于 酶标板，4°C过夜，含0.5 % Tween-20 (V/V)的磷酸缓冲液（PBST)洗板5次，拍干板条，加入 3%脱脂牛奶（W/V)，300 μ L/孔，37°C封闭2h。PBST洗板3次后，每孔加入50 μ L加入本发 明针对六?81单域重链抗体和50 μ L AFB ^示准品溶液或待测样品，水平方向轻轻混匀，37°C 温育lh。PBST洗板5次，拍干，加入辣根过氧化物酶标记的兔抗His Tag标签抗体，100 μ L/ 孔，37°C温育lh。PBST洗板5次，拍干，加入10(^17孔了1^显色液，37°(：避光显色51^11。 加入50 μ L/孔终止液（2M H2SO4),酶标仪读数。根据测定的吸光值计算样品中AFB1的含 量。
【主权项】
1. 针对黄曲霉毒素的单域重链抗体，具有SEQIDNO. :1所示的氨基酸序列。2. -种核酸分子，其特征是编码权利要求1中所述氨基酸序列。3. 包含权利要求2所述的核酸序列的载体。4. 包含权利要求3所述载体的宿主细胞。5. 权利要求1所述的针对黄曲霉毒素的单域重链抗体在免疫检测、黄曲霉毒素富集以 及纯化中的应用。6. 权利要求1所述的针对黄曲霉毒素的单域重链抗体在制备黄曲霉毒素免疫检测、富 集以及纯化试剂或材料中的应用。7. 权利要求1所述的针对黄曲霉毒素的单域重链抗体通过随机或定点突变技术进行 改造所获得的能与黄曲霉毒素特异性结合的抗体。
【专利摘要】本发明属于生物技术领域，涉及单域重链抗体技术，具体为针对黄曲霉毒素的单域重链抗体，其具有SEQ？ID？NO.：1所示的氨基酸序列。该抗体具有耐酸碱、耐高温以及易于生产等特性，对于黄曲霉毒素的低成本、可重复使用的免疫学检测方法有重要的实用价值。
【IPC分类】G01N33/543, C12N15/13, C07K16/14
【公开号】CN105399825
【申请号】CN201510869908
【发明人】吴红静, 涂追, 许杨, 熊勇华
【申请人】南昌大学
【公开日】2016年3月16日
【申请日】2015年12月2日