样IOg装入90mL无菌水的三角瓶中，在28°C和150r/min摇床振荡2h后沉 淀30min制成土壤悬液，各取0.1 mLlO \ 10 2、10 3、10 4、10 5浓度的土样悬液，用涂布法涂布 在筛选固体培养基（PDA培养基）平板上，28°C培养4-5d，然后挑选单菌落，用同样方法划线 分离，经多次纯化，获单菌株，将纯化的菌种放入4°C冰箱中保存备用。
[0037] ②将纯化好的菌株接种到有重金属的PDA培养基中，培养基中Cd2+离子和Pb 2+离 子的浓度分别以 1〇〇、200、400、600、800、1000mg/L 和 200、400、600、800、1000、1500mg/L 的 梯度依次进行划线，选出重金属耐受性较好的菌株。
[0038] ③将选出的菌株接入到混合的金属离子培养基中，培养基中Cd2+离子和Pb 2+离子 的浓度为 100&400、200&600、400&800、800&1000、800&1500mg/L 的梯度依次进行划线，选出 抗性较强的菌株。
[0039] 经过上述筛选步骤，筛选出一株抗性最强的QDlO菌株。其中该菌株的最低抑菌浓 度（MIC)为镉（Cd 2+) 1000mg/L，共同抗性为 800&1500mg/L(Cd2+&Pb2+)。
[0040] I. 3 QDlO菌株的微生物形态与理化性质鉴定
[0041] I. 3. I QDlO菌株的微生物形态
[0042] 观察菌落特征，在显微镜下观察孢子和菌丝特征。
[0043] I. 3. 2 QDlO菌株的理化性质测定
[0044] 明胶液化测定：接种测试菌株QDlO菌株于明胶表面，28°C下暗培养，每隔5d观察 一次。先将试管低温冷却，待未接种的CK试管中明胶凝固后观察记录。如无蛋白酶水解作 用则冷却后明胶不液化，反之则表明有蛋白酶水解作用。
[0045] 淀粉水解测定：将培养基倒入培养皿中，待培养基凝固后采用点接法接种，28 °C下 暗培养10~20d后，将配制好的碘液倒入培养基表面。如有淀粉酶产生，则菌落的周围不 会变为蓝色，反之则变成蓝色，表明有淀粉酶产生。利用形成的透明圈来检测是否产生淀粉 酶。
[0046] 麦芽糖或纤维素利用测定：将基础培养基中的碳源葡萄糖换成麦芽糖或纤维素， 其余培养基成分不变，观察QDlO菌株能否正常生长。
[0047] 纤维素水解测定：将一个滤纸条放置在试管的培养基中，一半浸入培养基中一半 在培养基上，将待测菌株接种于已灭菌的试管中的滤纸条上，28°C培养30d后，观察其是否 能在滤纸条上生长。
[0048] 生长温度和pH范围测定：将QDlO菌株接种PDA培养基中，在不同温度下，培养7 天，离心收集菌株，收集的菌株置于65°C烘烤4小时后称重，根据该菌的菌株干重（g/L)，可 知该菌的生长温度范围；
[0049] 在最佳生长温度30°C条件下，按同样的方法，测定菌株干重，根据该菌的菌株干重 (g/L)，可知该菌的生长的pH范围。
[0050] I. 3. 3 QDlO菌株的分子生物学鉴定
[0051] 第一步：提取QDlO菌株DNA
[0052] (1)取真菌培养液l_5ml，10, OOOrpm离心lmin，尽量吸净上清；
[0053] (2)向菌株沉淀中加入200 μ 1缓冲液GA，振荡至菌株彻底悬浮；
[0054] (3)向管中加入20 μ IProteinaseK溶液，混勾；
[0055] (4)加入220 μ 1缓冲液GB，振荡15sec，70°C放置lOmin，溶液应变清亮，短暂离心 以去除管盖内壁的水珠；
[0056] (5)加220 μ 1无水乙醇，充分振荡混匀15sec，此时可能会出现絮状沉淀，短暂离 心以去除管盖内壁的水珠；
[0057] (6)将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中（吸附柱放入收集管 中），12, OOOrpm离心30sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中；
[0058] (7)向吸附柱CB3中加入500 μ 1缓冲液⑶，12, OOOrpm离心30sec，倒掉废液，将 吸附柱CB3放入收集管中；
[0059] (8)向吸附柱CB3中加入600 μ 1漂洗液PW，12, OOOrpm离心30sec，倒掉废液，吸 附柱CB3放入收集管中；
[0060] (9)重复操作步骤⑶；
[0061] (10)将吸附柱CB3放回收集管中，12, OOOrpm离心2min，倒掉废液，将吸附柱CB3 置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液；
[0062] (11)将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加 50-200 μ 1洗脱缓冲液TE，室温放置2-5min，12, OOOrpm离心2min，将溶液收集到离心管中。
[0063] 第二步：使用通用引物进行PCR扩增18s-rDNA片段，将扩增后的PCR产物进行跑 胶电泳，查看条带。
[0064] 反应体系：10ul体系。其中5ul Master Mix，正向引物与反向引物各0.2ul， ddH2〇-l· 6ul，菌 DNA 模版 3ul。
[0065]
[0066] 第三步：切胶回收纯化PCR产物
[0067] ①加入500ul的溶胶液，55°C水浴lOmin，（计时器定时）使胶块完全熔化，每2min 颠倒混匀一次；
[0068] ②目的片段< 500bp时，加入IOOul的异丙醇，混匀。55°C水浴lmin，混匀。目的 片段>500bp时，可省略该步骤；
[0069] ③转移：将溶化的Agarose液移入吸附柱，12000rpm离心40sec。倒掉收集管中的 液体，再将吸附柱放入同一个收集管中；
[0070] ④在吸附柱中加入500ul漂洗液，12000rpm离心40sec。倒掉收集管中的液体，再 将吸附柱放入同一个收集管中。如果室温低于20°C，离心前先静置Imin ;
[0071] ⑤在吸附柱中加入500ul漂洗液，12000rpm离心40sec。倒掉收集管中的液体，将 吸附柱放入同一个收集管中；
[0072] ⑥ 12000rpm 离心 2min，静置 IOmin ;
[0073] ⑦将吸附柱放入一个干净的I. 5ml离心管中。在吸附膜中央加入30ulTE洗脱液 (根据电泳条带亮度决定），静置5min，12000rpm离心2min。
[0074] 第四步：用BigDye terminator试剂盒处理样品，使用ABI3730DNA测序仪进行毛 细管电泳，检测样品中DNA的荧光化学标记，通过数据处理得到样品DNA的序列。
[0075] I. 4 QDlO菌株在不同条件下的吸附效果
[0076] 将QDlO菌株在不同条件下测定其重金属吸附效果，其中包括温度、pH值、接菌量 和时间，考察菌株的吸附效果。
[0077] 1. 4. 1不同投菌量对QDlO菌株吸附效果的影响
[0078] 在250ml的三角瓶中加入100mL的去离子水，在三角瓶中加入浓度为50mg/L的 Cd2+和100mg/L的Pb 2+的溶液，温度为30°C，pH值为自然，加入不同量菌丝（0g，0· 2g，0· 4g， 0. 6g，0. 8g，I. 0g，I. 2g，I. 4g)震荡60min后离心，取上清液，测定上清液中Cd2+和Pb 2+的浓 度，研究不同投菌量对QDlO菌株吸附效果的影响。
[0079] 1. 4. 2不同pH值对QDlO菌株吸附效果的影响
[0080] 真菌生长情况与环境酸碱性密切相关，而在镉和铅污染环境pH值通常较低，故研 究此菌株是否具备适应酸性环境的能力。在250ml的三角瓶中加入不同pH值（pH值为 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9)的IOOrnl的去离子水，在三角瓶中加入浓度为50mg/L的Cd2+和100mg/L的 Pb2+的溶液，温度为30°C，加入0. 2g菌丝震荡60min后离心，取上清液，测定上清液中Cd 2+ 和Pb2+的