1-713);2个次甲基氢信号5!1 2.59-2.93(111，1!1，!1-2)和5!11.94((1(1，了 = 3.6,9.6!12，1!1，!1-5)。 在13C-NMR谱中，共给出了 10个碳信号，结合DEPT谱和1H-NMR谱得到：1个羰基，2个sp3杂化的 季碳，2个sp 3杂化的次甲基，3个sp3杂化的亚甲基，和2个甲基。1Η」Η COSY谱图提示有2个片 段的存在：a: -CH2CH-; b: -CH2CHCH3-0
[0034] 通过HMBC谱中可以看出，δΗ 1.85(dd，J = 9.0，18.6Hz，lH，H-3a)jH 2.23(dd，J = 9.1，18.6抱，1!1，!1-313)与3〇216.85(8，(：-4)相关、3!11.94((1(1，了 = 3.6,9.6抱，1!1，!1-5)与3〇 43.45(扒03)相关，说明03、(：-5与羰基(：-4相连4!1 2.59-2.93(111，1!1，!1-2)和5!11.16((1(1， 了 = 3.6,4.8，他，1!1，!1-7&)，3!11.49((1(1，了 = 4.8,9.6抱，1!1，!1-713)与3〇 73.02(8，(：-1)相关， 说明C-2，C-7与C-1 相连；δΗ 3.54((1, J = 11.4Hz，lH，H-9a)，δΗ 3.56((1, J = 11·4Ηζ，1H，H-9b)与SC 73.02(s，C-l)，SC 45.74(s，C-6)jC 24.22(q，C-8)相关，说明羟甲基C-9与C-6相 连。根据其氢谱、碳谱数据与已知化合物10-Hydroxy verbenon比较，具有相类似的骨架类 型，属于蒎烷型单萜，区别在于C-2和C-3位缺失双键以及羟基的位置在C-9上而非C-10。因 此，最终确定该化合物结构为如下所示，核磁数据见表1。
[0036] 表1化合物Frp 14a的氢谱和碳谱数据(MeOD)
[0037]
[0038] 实施例3抗真菌活性测定
[0039] 石膏样小孢子菌是一类能够引起浅层皮肤癣病的丝状真菌，能够导致体癣、股癣、 甲癣、头癣等，是临床常见浅部致病真菌。近些年来药用植物在治疗皮肤病方面的作用备受 关注，寻求和利用天然药用植物中的活性成分设计新型无毒治疗皮肤病的药物是一个重要 的研究方向。最小抑菌浓度(Minimum inhibitory concentration,MIC)是衡量抗菌药物活 性大小的重要指标，采用试管药基法，不仅可以方便地判读MIC值，而且简便经济，容易操 作。
[0040] 本实验参考临床实验室标准化协会(CLSI)推荐的《产孢丝状真菌微量肉汤稀释法 药物敏感试验方案》(M38-A2)研究分离得到的单体化合物的活性。
[0041 ] 1.试验单体化合物
[0042]实施例1分离得到的式I化合物。
[0043] 2.试验菌株
[0044] 石膏样小孢子菌菌株购于中国医学科学院南京皮肤病医院。
[0045] 3.试验仪器
[0046]
[0047] 4.试验试剂
[0048]
[0049] 5.培养基的配制
[0050] 在无菌条件下，取新鲜的改良型1640(含L-谷氨酰胺不含碳酸盐)培养基1000mL， 用浓度为〇. 165mol/L的3-(N-吗啉基)-丙磺酸缓冲液将培养基pH值调至7.0，然后用0.22μπι 的微孔滤膜过滤除菌并分装，4°C保存备用。
[0051 ] 6.菌悬液的制备
[0052]在无菌条件下，取生长旺盛的石膏样小孢子菌试管斜面加入无菌生理盐水，用接 种环轻轻刮取培养基表面的丝状培养物，投放到已做无菌处理的研钵中研磨，用血细胞计 数板计数，将菌悬液的浓度用改良1640液体培养基调整到0.5 X 103-2 X 103CFU/mL备用。 [0053] 7.试验方法
[0054]药敏板的制备
[0055]分别准确称取一定质量的单体化合物和灰黄霉素片粉末，加入一定体积的DMS0且 含量少于1 %，配制成〇. 8mg/mL的储备液，然后用改良后的1640液体培养基将储备液按1:25 稀释至2倍终浓度，即32yg/mL。用移液器分别取200yL已制备好的32g/mL的药液加入96孔板 每一行的第1孔;第2-11孔分别加入lOOyL改良后的1640液体培养基；用移液器从第1孔取 100yL药液注入第2孔，依次2倍稀释至第10孔，并将从第10孔取的100yL药液弃除，最终得到 1-10 孔药液浓度分别为 32yg/mL、16yg/mL、8yg/mL、4yg/mL、2yg/mL、lyg/mL、0.5yg/mL，0 · 25 yg/mL、0.125以8/1111^、0.0625以8/1]11^十个梯度浓度;然后1-11孔分别加入10(^1^菌悬液，第11孔 作为生长对照，第12孔加入200yL的改良1640液体培养基作为空白对照;每个样品设三个重 复，每个样品设生长对照和空白对照。
[0056]抑菌结果判定
[0057]将已接种菌悬液的药敏板置于28(±1)°C恒温培养箱中培养，7天后取出，单体化 合物对该菌种的MIC值为100%抑制生长的药物浓度，即肉眼观察澄清或未见生长。
[0058] 8.结果
[0059]为了寻找西藏大花黄牡丹根皮乙酸乙酯层中对石膏样小孢子菌具有抗性的单体 化合物，我们利用从乙酸乙酯层组分分离得到的新单体化合物开展了对石膏样小孢子菌抗 性试验，试验结果测定得知实施例1分离得到的式I化合物对石膏样小孢子菌的MIC值为8μ g /m L，与对照品灰黄霉素 ΜIC 0.5 μ g / m L相比，说明该化合物对石膏样小孢子菌有一定的抑 制作用。
【主权项】
1. 一种蒎烷型单萜类化合物，其特征在于:所述的化合物结构式如式I所示：2. 根据权利要求1所述的一种蒎烷型单萜类化合物，其特征在于:所述化合物为无色油 状，分子式为Cl〇Hl6〇3，不饱和度为3。3. 权利要求1所述的化合物的制备方法，其特征在于包括以下步骤： 1) 取干燥的西藏大花黄牡丹根皮粉碎后，加入95 %乙醇，室温浸提24h，重复抽滤，50°C 减压浓缩，利用乙酸乙酯进萃取，将萃取液在50°C条件下减压浓缩，得到干粉A; 2) 将干粉A与聚酰胺按质量比1:4~5的比例混合，利用体积浓度为20%的甲醇水溶液 洗脱得到组分B; 3) 将组分B用硅胶拌样，用石油醚和乙酸乙酯体积比为3:2的混合液洗脱，得到组分C; 4) 将组分C进行硅胶柱色谱，用石油醚和异丙醇体积比为6:1的混合液洗脱，得到组分 D； 5) 将组分D继续进行硅胶柱色谱，用甲醇洗脱，分离纯化得到式I单体化合物。4. 根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：步骤（1)中根皮与95%乙醇的质量体 积比为1:10。5. 根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于:步骤(2)中干粉A与聚酰胺按质量比1: 4.2的比例混合。6. 权利要求1所述式I化合物作为抗真菌药物的应用。
【专利摘要】本发明公开了一种蒎烷型单萜类化合物，其结构式为该化合物的分子式为C10H16O3，其不饱和度为3，紫外光谱显示该化合物紫外最大吸收在203nm。本发明还涉及该化合物的提取分离方法，利用乙酸乙酯进行萃取，并将萃取液分离、纯化，得到本发明单体化合物。该化合物对抗真菌的活性作用，为开发抗真菌的药物提供了先导化合物，对开发天然产物和植物药的新用途具有重要意义。
【IPC分类】A61P31/10, C07C45/78, C07C49/513
【公开号】CN105481670
【申请号】CN201510875134
【发明人】赵丹丹, 蒋帅, 李建平, 曾伟民, 曲宏悦, 蒋丽丽, 黄悦
【申请人】黑龙江大学
【公开日】2016年4月13日
【申请日】2015年12月2日