n，95°C变性30s，56°C退火30s，72°C延伸40s，进行25个循环，72°C再延伸5min。
[0043]9)PCR产物纯化:将扩增后的DNA片段的溶液用TE Buffer调整体积到100μ1，加入10倍体积的Binding Buffer I混勾。将混合液转移到吸附柱中，室温放置2min，8，000rpm离心2min。倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中。向吸附柱中加入500μ1 WashSolut1n，10，OOOrpm离心lmin。重复洗涤一次。倒掉收集管中的废液，将吸附柱放入同一个收集管中，10，000rpm离心2min。将吸附柱放入干净的1.5ml离心管中，在吸附膜中央加50μ1Elut1n Buffer，室温静置5min，12，OOOrpm离心lmin。
[0044]10)以P3和P4作为引物扩增的纯化B1-dsDNA与Dynabeads M_280Streptavidir^||床结合20min，吸弃上清，加新鲜配制的NaOH溶液37°C孵育30min，使dsDNA碱变性为ssDNA，再分离上清加等物质的量的HC1溶液中和，测定其浓度，得到下一轮文库。
[0045]11)第8轮筛选后，将筛选产物用P1和P2进行扩增、纯化，用pEASY-TlSimpleCloning Kit进行ΤΑ克隆。
[0046]12)随机挑取阳性克隆进行增菌培养，送上海生工生物工程技术有限公司进行测序分析。运用DNAMAN7.0软件分析其一级结构的同源性并模拟二级结构。
[0047]13)通过测定结合荧光强度，比较测序适配体与靶标的结合情况。我们发现适配体Τ_7(参见图2)具有的较强结合力。
[0048]实施例2荧光定量法检测适配体Τ-7与中毒性休克毒素-1的特异性
[0049]1)体外化学合成获得FAM荧光标记的适配体稀释为150ηΜ。
[0050]2)适配体95°C预变性反应lOmin，然后迅速放置冰上冷却5min。
[0051 ] 3)将包被TSST-1及BSA的磁珠分别与FAM标记的候选适配体避光孵育lh，以裸磁珠作为空白对照，0.1 % PBST洗3遍。
[0052]4)运用TBS-380荧光定量仪分析结合前后适配体的荧光强度。
[0053]5)每个数据做平行三个样本。
[0054]将测定的荧光强度值通过GraphPad Prism v5.0软件作出结果分析图，如图2所示，横坐标分别为空白对照裸磁珠，BSA，TSST-1，纵坐标为平均荧光强度，比较各组荧光强度值可见:适配体T-7与TSST-1结合的荧光强度显著高于与裸磁珠及BSA的结合。
[0055]实施例3荧光定量法检测适配体T-7的亲和力
[0056]1)体外化学合成获得FAM荧光标记的适配体。
[0057]2)使用011]\1、62.511]\1、12511]\1、25011]\1、50011]\1梯度浓度的适配体与靶蛋白了551'-1来测定解离常数Kd。
[0058]3)将配好各浓度的适配体95°C预变性反应lOmin，然后迅速放置冰上冷却5min。
[0059]4)将包被TSST-1的磁珠与不同浓度FAM标记的候选适配体避光孵育lh，0.1%PBST洗3遍。
[0060]5)运用TBS-380荧光定量仪检测结合前后适配体的荧光强度变化。
[0061 ] 6)每个数据做平行三个样本。
[0062]将测定的焚光强度值通过GraphPad Prism v5.0软件作出结果分析图，如图3所示，横坐标为适配体T-7的浓度(nmol/L)，纵坐标为平均焚光强度，并运用GraphPad Prismv5.0软件拟合适配体T-7的解离曲线，测定其Kd值为103.8nM。
[0063]实施例4适配体对TSST-1超抗原活性的作用
[0064]1)用一次性真空抗凝采血管抽取健康志愿者静脉血2ml。
[0065]2)在无菌条件下，将抗凝血取出置于15ml离心管中，再加入等量D-Hank’s溶液充分混勾。
[0066]3)加入等体积的人淋巴细胞分离液于15ml离心管。
[0067]4)沿管壁缓慢加入等量1:1稀释的血液于分离液上方，保持两液面界面清晰。
[0068]5)水平800g 离心 20min。
[0069]6)收集界面中间白色富含PBMCs层于另一支15ml离心管中。
[0070]7)加入适量D-Hank ’ s溶液混匀洗涤，500g离心20min。
[0071]8)弃去上清后再加入适量D-Hank’s溶液洗绦一次，500g离心20min。
[0072]9)弃去上清，所得细胞沉淀则为PBMCs。
[0073]10)用含10%小牛血清的RPM1-1640稀释至lml，通过血细胞仪计数PBMCs。
[0074]11)将人PBMCs接种105个/孔(ΙΟΟμΙ)至96孔培养板中，做3个复孔。
[0075]12)加入TSST-1终浓度为250ng/ml，同时加入不同浓度适配体使其终浓度为5μΜ，10μΜο
[0076]13)设置不加适配体的对照孔。
[0077]14)置37°C、5 % C02饱和湿度下培养24h。
[0078]15)加入 10μ1 CCK-8。
[0079]16)培养4h，应用酶标板自动读数仪测定450nm吸光度，结果以3个复孔0D值的均值表不。
[0080]通过GraphPad Prism v5.0比较各组0D值，如图4所示，横坐标为适配体T-7的浓度，纵坐标为450nm处的0D值。当适配体为10μΜ时，TSST-1刺激PBMCs的增殖水平明显降低(P<0.05)，适配体T-7在体外实验中对TSST-1的超抗原活性有抑制作用，是一种潜在的TSST-1抑制剂。
[0081]本发明包括但不限于以上实施例，凡是在本发明的精神和原则下进行的任何等同替换或局部改进，都将视为在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1.一种金黄色葡萄球菌中毒性休克毒素-1核酸适配体T-7，其特征在于:该核酸适配体T-7的序列如下所示: tgcgtgtgta gtgtgtctgt gggccaggtc cctattataa ataactctta gggatttggg 60egg632.根据权利要求1所述的金黄色葡萄球菌中毒性休克毒素-1核酸适配体T-7，其特征在于:所述核酸适配体T-7的二级结构为茎环结构，其分子结构如图1所示。3.根据权利要求1或2所述的金黄色葡萄球菌中毒性休克毒素-1核酸适配体T-7，其特征在于:对核酸适配体T-7的5’-端或3’-端进行FAM、B1tin、氨基化学修饰。4.根据权利要求1至3中任意一项所述的金黄色葡萄球菌中毒性休克毒素 -1核酸适配体T-7的制备方法，其特征在于，通过下述方法制得: 采用核酸适配体的体外SELEX筛选技术，利用羧基磁珠作为固相介质，以TSST-1为靶标，通过TSST-1羧基磁珠从ssDNA文库中筛选得到中毒性休克毒素-1适配体。5.根据权利要求4所述的金黄色葡萄球菌中毒性休克毒素-1核酸适配体T-7的制备方法，其特征在于:所述的ssDNA文库，两端为19nt的固定引物序列，中间25nt为随机序列: 5'-TGCGTGTGTAGTGTGTCTG-N25-CTCTTAGGGATTTGGGCGG-3’。6.根据权利要求1至3中任意一项所述的金黄色葡萄球菌中毒性休克毒素-1核酸适配体T-7的应用，其特征在于:在制备金黄色葡萄球菌中毒性休克毒素-1的纯化和检测试剂中的应用。7.根据权利要求1至3中任意一项所述的金黄色葡萄球菌中毒性休克毒素-1核酸适配体T-7的应用，其特征在于:在研制治疗金黄色葡萄球菌中毒性休克毒素-1相关疾病的药物中的应用。
【专利摘要】本发明涉及一种金黄色葡萄球菌中毒性休克毒素-1核酸适配体T-7及其制备方法和应用，核酸适配体T-7的二级结构为茎环结构，其中茎多由G≡C配对组成，并连接大小不一的环，本发明采用核酸适配体的体外SELEX筛选技术，利用羧基磁珠作为固相介质，以TSST-1为靶标，通过TSST-1羧基磁珠从ssDNA文库中筛选得到中毒性休克毒素-1适配体，该核酸适配体可以在制备金黄色葡萄球菌中毒性休克毒素-1的纯化和检测试剂中应用以及在研制治疗金黄色葡萄球菌中毒性休克毒素-1相关疾病的药物中应用，该核酸适配体能高亲和力、高特异性地与TSST-1结合，可作为抑制TSST-1活性的一种潜在的拮抗剂。
【IPC分类】C12N15/115, C12N15/10, G01N33/68, A61P31/04, A61K31/7088
【公开号】CN105483133
【申请号】CN201510837014
【发明人】兰小鹏, 王开宇, 陈弘炜, 杨湘越
【申请人】中国人民解放军南京军区福州总医院
【公开日】2016年4月13日
【申请日】2015年11月26日