因 ca巧L12。
[0化1 ] 表1邻苯二酪1，2-双加氧酶基因 ca巧L12克隆用引物
[0化 2]_
[0053] 表1 中，r=a/G，Y = C/T，M=A/C，K = G/T，S = C/G，W=A/T，H=A/C/T，B = C/G/T，V = A/C/G，D=A/G/T，N=A/C/G/T。
[0054] 实施例2低溫邻苯二酪1,2-双加氧酶化巧L12的制备
[0055] 将实施例1制备的邻苯二酪1,2-双加氧酶基因 ca巧L12与质粒祀asy-E2连接得到 重组表达载体pEas厂E2-cat化12,然后转化大肠杆菌化2UDE3)获得重组大肠杆菌菌株 化21(DE3)/ca巧L12。取含有重组表达载体祀asy-E2-ca巧L12的大肠杆菌菌株化21(DE3)/ ca巧L12，W〇.l%的接种量接种于LB(含l(K)yg/mL Amp)培养液中，37°C快速振荡16h。然后 将此活化的菌液W1 %接种量接种到新鲜的LB(含10化g/mL Amp)培养液中，快速振荡培养 约2-化(ODsqq达到ο. 6-1.0)后，加入终浓度ο. 7mmol/L的IPTG诱导，于20°C继续振荡培养约 20ha20(K)rpm离屯、5min，收集菌体。用适量的抑7.0化is-HCl缓冲液悬浮菌体后，于低溫水 浴下超声波破碎菌体。W上胞内浓缩的初酶液经13,000rpm离屯、lOmin后，吸取上清并用 Nickel-NTA Agarose纯化目的蛋白，得到低溫邻苯二酪1,2-双加氧酶化巧L12。
[0056]对所述纯化目的蛋白进行SDS-PAGE分析，结果参见图2,图2是本发明实施例提供 的在大肠杆菌中表达的重组邻苯二酪1,2-双加氧酶的SDS-PAGE分析，其中，M:低分子量蛋 白质Marker; 1:含有重组邻苯二酪1，2-双加氧酶的大肠杆菌培养上清液;5:纯化的重组邻 苯二酪1,2-双加氧酶。由图2可知，重组邻苯二酪1,2-双加氧酶在大肠杆菌中得到了表达， 经Nickel-NTA Agarose纯化后为单一条带。
[0化7] 实施例3低溫邻苯二酪1,2-双加氧酶化巧L12的性质测定 [0化引 1、低溫邻苯二酪1，2-双加氧酶化巧L12的活性分析
[0059] 酶活性测定方法采用分光光度法[Gou et al.Biotechnol Lett ,2012,34(1): 117-123]:取10μ1 150mM邻苯二酪底物溶液(终浓度为0.5mM)和2.94血50mM缓冲液在反应 溫度下预热3min，加入50μ1适当稀释的酶液反应5min，在相应波长处测定5min内吸光度的 增加值。W邻苯二酪为底物的催化产物顺，顺-己二締二酸在260nm处的摩尔消光系数为 16800/M cm<a个酶活单位化)定义为在给定的条件下每分钟催化底物生成Ιμηιο?相应产物 所需的酶量。
[0060] 2、低溫邻苯二酪1,2-双加氧酶的最适抑和pH稳定性的测定方法如下：
[0061 ]酶的最适pH测定：将实施例2纯化的低溫邻苯二酪1,2-双加氧酶在30°C下和pH 2.2~pH 10.0的缓冲液中进行酶促反应。酶的抑稳定性测定:将纯化的酶液置于pH 2.2~ pH 10.0的缓冲液中，在30°C下处理化，然后在P册.0及25°C下进行酶促反应，W未处理的酶 液作为对照。缓冲液为:50mM巧樣酸-憐酸氨二钢缓冲液(pH2.2~抑8.0);50mM化is-HCl (抑8.0~抑9.0);50m甘氨酸-Na0H(pH9.0~抑10.0)。W邻苯二酪为底物，反应5min，?i 定纯化的低溫邻苯二酪1,2-双加氧酶的酶学性质。结果参见图3和图4,图3为本发明实施例 提供的低溫邻苯二酪1，2-双加氧酶的最适抑，图4为本发明实施例提供的低溫邻苯二酪1， 2-双加氧酶的pH稳定性。由图3和图4可知，本发明提供的低溫邻苯二酪1,2-双加氧酶的最 适pH为8.0，在pH 7.0~9.0之间可W保持70 % W上酶活;经抑7.0~10.0的缓冲液处理化 后，酶活剩余60 % W上。
[0062] 3、低溫邻苯二酪1,2-双加氧酶的最适溫度及热稳定性测定方法如下：
[0063] 酶的最适溫度测定:在抑8.0的缓冲液中，于0~50°C下进行酶促反应。酶的热稳定 性测定:将同样酶量的酶液置于设定的溫度(25°C、37°C、40°C或45°C)中处理化，或置于设 定的溫度(25°C或35°C)中处理26h后，在抑8.0及25°C下进行酶促反应，W未处理的酶液作 为对照。结果参见图5、图6和图7,图5是本发明实施例提供的低溫邻苯二酪1,2-双加氧酶的 最适溫度，图6是本发明实施例提供的低溫邻苯二酪1，2-双加氧酶的溫度稳定性I，图7是本 发明实施例提供的低溫邻苯二酪1,2-双加氧酶的溫度稳定性II。结果表明：低溫邻苯二酪 1，2-双加氧酶的最适溫度为25°C，在0°C和10°C分别具有约30%和60%的酶活;在25°C和37 °C条件下耐受化，其仍保持100%酶活;45°C条件下耐受lOmin，酶活迅速损失至约30%;其 在25°C条件下耐受26h，仍保持65%W上的酶活;35°C条件下耐受化后酶活开始下降，耐受 至26h时酶活仅剩余约20%。
[0064] W上性质表明，本发明制备的低溫邻苯二酪1，2-双加氧酶在顺，顺-己二締二酸的 酶法合成W及低溫环境中芳香族化合物的降解方面具有潜在的应用前景。
[0065] W上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人 员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可W做出若干改进和润饰，运些改进和润饰也应 视为本发明的保护范围。
【主权项】
1. 一种动物粪便宏基因组来源的低温邻苯二酚1，2-双加氧酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。2. -种编码权利要求1所述的低温邻苯二酚1，2-双加氧酶的基因。3. 根据权利要求2所述的基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。4. 一种包含权利要求2所述的基因的重组表达载体。5. -种利用权利要求4所述的重组表达载体转化宿主细胞所得的重组菌株。6. 权利要求1所述的低温邻苯二酚1，2_双加氧酶在合成顺，顺-己二烯二酸中的应用。7. 权利要求1所述的低温邻苯二酚1，2_双加氧酶在低温环境中降解芳香族化合物的应 用。8. 权利要求1所述的低温邻苯二酚1，2-双加氧酶在降解多环芳烃中的应用。9. 一种如权利要求1所述的低温邻苯二酚1，2_双加氧酶的制备方法，其特征在于，包括 以下步骤： 将邻苯二酚1，2_双加氧酶基因的重组表达载体转化宿主细胞得到重组菌株，培养重组 菌株，诱导重组邻苯二酚1，2-双加氧酶表达； 回收并纯化所表达的邻苯二酚1，2_双加氧酶，得到低温邻苯二酚1，2_双加氧酶。10. 根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，所述邻苯二酚1，2_双加氧酶基因按 照以下方法获得： 从倭蜂猴粪便中提取微生物基因组DNA; 以所述微生物基因组DNA为模板，以SEQIDN0.3所示的引物catPL12F和SEQIDN0.4 所示的引物catPL12R进行PCR扩增，得到邻苯二酚1，2_双加氧酶基因。
【专利摘要】本发明公开了一种动物粪便宏基因组来源的低温邻苯二酚1,2-双加氧酶，其氨基酸序列如SEQ？ID？NO.2所示，共309个氨基酸，理论分子量为33.72kDa；其编码基因核苷酸序列如SEQ？ID？NO.1所示，基因大小为930bp。该低温邻苯二酚1,2-双加氧酶最适作用pH为8.0，在pH？7.0～9.0范围内处理1h后，酶活剩余60％以上；最适作用温度为25℃，在0℃和10℃分别具有约30％和60％的酶活；25℃和37℃下耐受1h对酶活无影响，25℃条件下耐受26h仍保持65％以上的酶活，可用于顺,顺-己二烯二酸的酶法合成以及低温环境中芳香族化合物的降解。
【IPC分类】C12N15/53, C12N9/02
【公开号】CN105505893
【申请号】CN201610027053
【发明人】许波, 熊彩云, 黄遵锡, 李俊俊, 唐湘华, 杨云娟
【申请人】云南师范大学
【公开日】2016年4月20日
【申请日】2016年1月15日