P的感兴趣 的核酸序列。例如，可W引入化el位点W在插入位点侧翼。
[010引C.将核酸分子投递入含有ELP的植物细胞中
[0109] 为了经由祀向性整合实现感兴趣的核酸分子(例如，ELP和/或祀向至先前整合的 ELP的外源核酸分子)对植物基因组的祀向性内切核酸酶介导的整合，需要投递祀向性内切 核酸酶或祀向性内切核酸酶编码核酸分子，接着在植物细胞中表达功能性祀向性内切核酸 酶蛋白。感兴趣的核酸分子还应当与其中投递或表达祀向性内切核酸酶同时存在于植物细 胞中，使得功能性祀向性内切核酸酶蛋白可W在祀位点处诱导双链断裂，然后，其经由感兴 趣的核酸分子对祀基因座的同源性驱动的整合来修复。本领域技术人员可W设想可W通过 几种方法，包括但不限于祀向性内切核酸酶编码构建体的基因转移，或祀向性内切核酸酶 编码构建体的瞬时表达实现功能性祀向性内切核酸酶蛋白的表达。在运两种情况中，植物 细胞中功能性祀向性内切核酸酶蛋白的表达和供体DNA的投递可W同时实现W驱动祀向性 整合。
[0110] 如此，在具体的实施方案中，自经转化植物中的核酸分子表达祀向性内切核酸酶 (例如，ZFN) W在经转化的植物的基因组中，例如在先前引入植物的一个或多个ELP中引入 双链断裂。可W使用祀向性内切核酸酶，其祀向设计为存在于化P中的一个或多个识别序 列。因此，可W通过确定一种或多种特定的核酸序列开始用于构建本发明的化P的设计和选 择方法，所述一种或多种特定的核酸序列由随后要用于在化P处引入感兴趣的核酸分子的 祀向性内切核酸酶识别。ZFN系统的柔性和特异性提供先前通过已知的重组酶介导的基因 切除策略不可实现的控制水平。
[0111] 作为一个例子，可W容易地工程化改造 ZFN，例如W识别特定的核酸序列（例如， ELP) dWu等（2007)Cell .Mol 丄ife Sci .64:2933-44。锋指识别残基的密码子的随机化容许 选择对任意选择的DNA序列具有高亲和力的新指。此外，锋指是天然的DNA结合分子，并且已 经显示了工程化锋指对活细胞中其设计的祀物起作用。如此，基于锋指的核酸酶可祀向特 定的但任意的识别位点。
[0112] 对嵌合锋指核酸酶的切割域的二聚化的需要赋予高水平的序列特异性。因为Ξ个 指的每组结合9个连续的碱基对，所W若每个锋指域具有完全的特异性，则两个嵌合核酸酶 有效要求18bp祀物。此长度的任何给定序列预测为在单一基因组内是独特的（假设约 109bp)eBibikova 等（2001)Mol.Cell.Biol.21(l):289-97;Wu 等（2007)，见上文。此外，其它 指提供增强的特异性，866^1等（1998化'〇。.船*1.4。曰(1.5(^.1]54 95:14628-33;1(山和化6〇 (1998)Proc.化tl.Acad.Sci.USA 95:2812-7;^11等（1997冲'〇。.化11.4。日(1.5(^.1]5八94: 5525-30，因此可W增加每个DNA结合域中的锋指数目W提供甚至进一步的特异性。例如，可 W通过使用识别24bp序列的一对4指ZFN来进一步提高特异性。化nov等(2005)化化re 435: 646-51。如此，可W使用ZFN，使得导入宿主植物基因组中的化P中的识别序列在基因组内是 独特的。
[0113] 通过化P处的祀向性重组引入的感兴趣的核酸分子可足够的量与驱动基因表 达的一种或多种植物启动子可操作连接W赋予期望的性状或表型。适合于运种和其它用途 的启动子是本领域中公知的。描述此类启动子的非限制性例子包括美国专利No.6,437,217 (玉米RS81启动子）；5,641，876(稻肌动蛋白启动子）；6,426,446(玉米35324启动子）；6， 429，362(玉米PR-1启动子）；6,232,526(玉米A3启动子）；6,177，611(组成性玉米启动子）； 5,322，938、5,352，605、5,359,142、和 5,530，196(35S 启动子）；6,433,252(玉米 L3 油质蛋白 启动子）；6，429，357(稻肌动蛋白2启动子和稻肌动蛋白2内含子）；5，837，848(根特异性启 动子）；6,294,714(光诱导型启动子）；6，140,078(盐诱导型启动子）；6,252，138(病原性诱 导型启动子）；6,175,060(憐缺乏诱导型启动子）；6,388,170(双向启动子）；6,635,806 (gamma-慧巧辛（coixin)启动子）；和美国专利申请流水号09/757,089(玉米叶绿体醒缩酶 启动子）。其它启动子包括姻脂氨酸合成酶（N0S)启动子（Ebert等（1987) Proc.化tl. Acad. Sci . USA 84( 16): 5745-9);章鱼碱合酶(0CS)启动子（其在根癌±壤杆菌 的肿瘤诱导质粒上携带）；花挪菜花叶病毒（caul imovirus)启动子，诸如花挪菜花叶病毒 (CaMV)19S启动子化awton等（1987)Plant Mol.Biol.9:315-24) ;CaMV 35S启动子(Odell等 ( 1985) Nature 313 :810-2 ;玄参花叶病毒 35S 启动子（Walker 等（ 1987) Proc.化 tl. Acad. Sci. USA 84(19) :6624-8);薦糖合酶启动子（Yang 和 Russel 1(1990) Proc.化tl.Acad.Sci.USA 87:4144-8) ;R基因复合物启动子（畑andler等（1989)Plant Cell 1:1175-83);叶绿素 a/b结合蛋白基因启动子;CaMV35S(美国专利No. 5,322，938,5， 352,605,5,359，142和5,530，196);尸]\^355(美国专利齡.6,051，753和5,378,619);口(：15￥启 动子(美国专利No. 5,850,019); SCPl启动子(美国专利No. 6,677,503);和AGIUu. nos启动子 (GenBank 登录号 V00087;D 邱 icker 等（1982)J.Mol.Appl.Genet.l:56173;Bevan 等（1983) NaUire 304:184-7)等。
[0114] 可W任选地与感兴趣的核酸分子可操作连接的其它遗传元件包括编码转运肤的 序列。例如，已经显示了合适的叶绿体转运肤，诸如拟南芥(A.thaliana化PSPS CTP化lee等 (1987 )Mol. Gen. Genet. 210 :437-42)和矮牵牛（Petunia hybrida)EPSPS CTP(del la Cioppa等（1986)Proc.化tl. Acad. Sci . USA 83:6873-7)的渗入将异源EPSPS蛋白序列祀向 至转基因植物中的叶绿体。也可W将麦草畏单加氧酶(Dicamba monoo巧genase ,DM0)革己向 至叶绿体，如记载于国际PCT公开文本No. WO 2008/105890的。
[0115] 可W任选地与感兴趣的核酸分子可操作连接的其它遗传元件还包括位于启动子 序列和功能为翻译前导序列的编码序列间的5'UTR。翻译前导序列存在于在翻译起始序列 上游的完全加工的mRNA中。翻译前导序列可W影响前转录物(prima巧transcript)加工成 mRNA、mRNA稳定、和/或翻译效率。翻译前导序列的例子包括玉米和矮牵牛热休克蛋白前导 物（美国专利No.5,362,865)、植物病毒壳体蛋白前导物、植物rubisco前导物等。见例如 Turner和Foster(1995)Molecular Biotech. 3(3) :225-36eS'UTR的非限制性例子包括 GmHsp(美国专利No.5,659，122);PhDnaK(美国专利No.5,362,865);AtAntl;TEV (Carrington 和 Freed(1990)J.Virol.64:1590-7);和 AGRtunos(GenBank 登录号 V00087;和 Bevan等（1983)NaUire 304:184-7)。
[0116] 可W任选地与感兴趣的核酸分子可操作连接的其它遗传元件还包括3'非翻译序 列、3'转录终止区、或多腺巧酸化区。运些是位于多核巧酸分子下游的遗传元件，并且包括 提供多腺巧酸化信号的多核巧酸、和/或能够影响转录、mRNA加工、或基因表达的其它调节 信号。多腺巧酸化信号在植物中发挥功能W引起多腺巧酸化核巧酸添加至mRNA前体的3' 端。多腺巧酸化序列可W源自天然基因、多种植物基因、或T-DNA基因。3'转录终止区的非限 制性例子是姻脂氨酸合成酶3 '区（nos 3 ' ；Fraley等（1983)P;roc.化tl. Acad. Sci .USA 80: 4803-7)。在Inge化recht等，（1989)植物细胞1:671-80中提供使用不同3'非翻译区的例子。 多腺巧酸化信号的非限制性例子包括来自魏豆(Pisum sativum)RbcS2基因（Ps.RbcS沈9; CoruzZ i等（1984化MB0 J. 3:1671 -9)和AGIUu. nos (GenBank登录号E01312)的。
[0117] D.用核酸分子转化宿主细胞
[0118] 可W使用用于将核酸分子导入植物中的本领域中已知的任何技术来生成依照本 发明的转化植物，例如W将一个或多个化P引入宿主植物基因组中，和/或W进行引入感兴 趣的核酸分子。认为适合于转化植物的方法实质上包括可W将DNA导入细胞中的任何方法， 诸如：通过电穿孔，如美国专利No . 5，384，253中例示的；通过微粒轰击，如美国专利No. 5， 015,580、5,550,318、5,538,880、6，160,208、6,399,861和6,403,865中例示的；通过±壤杆 菌属介导的转化，如美国专利No. 5,635,055，5,824,877，5,591,616;5,981,840和6,384， 301中例示的；及通过原生质体转化，如美国专利No.5,508,184中列出的，等等。经由应用诸 如运些技术，可W将实际上任何植物物种的细胞稳定转化，并且可W通过本领域技术人员 已知的技术将运些细胞开发成转基因植物。例如，可W在棉转化背景中特别有用的技术披 露于美国专利No. 5，846，797，5，159，135，5，004，863和6，624，344;特别地，用于转化芸苔属 (Brassica)植物的技术披露于例如美国专利No. 5,750,871;用于转化大豆的技术披露于例 如美国专利No. 6，384，301;并且用于转化玉米的技术披露于例如美国专利No. 7，060，876、 美国专利No.5,591,616和国际PCT公开文本WO 95/06722。
[0119] 在实现外源DNA对接受细胞的投递后，一般地，鉴定经转化的细胞W进一步培养和 植物再生。为了改善鉴定转化体的能力，可W期望与用于生成转化体的转化载体一起采用 选择或筛选标志基因。在此情况中，可W通过将细胞暴露于一种或多种选择剂来测定潜在 转化细胞群体，或者可W对细胞筛选期望的标志基因性状。
[0120] 可将幸免于对选择剂暴露的细胞，或在筛选测定法中得分为正的细胞在支持植物 再生的培养基中培养。在一些实施方案中，可通过包含其它物质，诸如生长调节物修饰任何 合适的植物组织培养基（例如，MS和N6培养基）。可将组织在具有生长调节物的基础培养基 上维持，直至足够的组织可用于开始植物再生努力，或者在手工选择的重复轮次后，直至组 织的形态学适合于再生（例如，至少2周），然后转移至进行枝条形成的培养基。周期性转移 培养物，直至已经发生足够的枝条形成。一旦形成枝条，便将它们转移至进行根形成的培养 基。一旦形成足够的根，可将植物转移至±壤^进一步生长和成熟。
[0121] 为了确认感兴趣的核酸分子在再生植物中的存在，可W实施多种测定法。此类测 定法包括例如：分子生物学测定法，诸如Southern和Nodhern印迹和PCR;生物化学测定法， 诸如检测蛋白质产物的存在，例如，通过免疫学手段化LISA和/或Western印迹)或者通过酶 功能;植物部分测定法，诸如叶或根测定法;和分析再生的全植物的表型。
[0122] 例如，可W使用例如对感兴趣的核酸分子特异性的寡核巧酸引物通过PCR扩增筛 选祀向性整合事件。PCR基因型分型理解为包括但不限于源自分离的宿主植物愈伤组织 (callus tissue)的基因组DNA的聚合酶链式反应(PCR)扩增，接着进行PCR扩增产物的标准 克隆和序列分析，所述宿主植物愈伤组织预测为含有整合入基因组中的感兴趣核酸分子。 PCR基因型分型的方法已经充分描述(例如，Rios，G.等(2002)Plant J.32:243-53)，并且可 W应用于源自任何植物物种或组织类型，包括细胞培养物的基因组DNA。可W在PCR扩增反 应中序贯使用或多重化(multiplex)结合祀序列和引入序列两者的寡核巧酸引物的组合。 设计为与祀位点、引入的核酸序列、和/或两种的组合退火的寡核巧酸引物是可行的。如此， PCR基因型分型策略可W包括(但不限于)扩增植物基因组中的特异性序列、扩增植物基因 组中的多个特异性序列、扩增植物基因组中的非特异性序列、或其组合。本领域技术人员可 W设计引物和扩增反应的其它组合W询问基因组。例如，一组正向和反向寡核巧酸引物可 W设计为与对在引入的核酸序列边界外部的祀物特异性的核酸序列退火。
[0123] 正向和反向寡核巧酸引物可W设计为与引入的感兴趣核酸分子(例如，在与感兴 趣的核酸分子内的编码区对应的序列处)或感兴趣的核酸分子的其它部分特异性退火。可 W与上文所描述的引物联合使用运些引物。寡核巧酸引物可W依照期望的序列合成，并且 是商品化的（例如，来自 Integrated DNA Technologies, IncCoralvilie, IA)。扩增可 W 继之W克隆和测序，或者对扩增产物的直接序列分析。本领域技术人员可W设想用于分析 PCR基因型分型期间生成的扩增产物的备选方法。在一个实施方案中，在PCR扩增中采用对 基因祀物特异性的寡核巧酸引物。
[0124] E.转基因植物的培养和使用
[0125] 包含一个或多个化P和/或通过在依照本发明的化P位点处的祀向性重组插入的感 兴趣的核酸分子的转基因植物可w具有一种或多种期望的性状。此类性状可w包括例如： 对昆虫、其它有害物和引起疾病的媒介物的抗性;对除草剂的耐受性;增强的稳定性、产量、 或货架期;环境耐受性;药物生成;工业产品生成;和营养增强。期望的性状可W由在展现出 期望性状的植物中表达的通过化P位点处的祀向性重组插入的一种或多种核酸分子赋予。 如此，在一些实施方案中，期望的性状可W是由于植物中存在转基因所致，所述转基因在 ELP位点处导入植物基因组中。在又一个实施方案中，可W经由常规育种获得期望的性状， 该性状可W由通过ELP位点处的祀向性重组插入的一种或多种核酸分子赋予。
[0126] 依照本发明的转基因植物可W是能够用本发明的核酸分子转化的任何植物。因 而，植物可W是双子叶植物或单子叶植物。在本方法中可用的双子叶植物的非限制性例子 包括首猜、豆、花茎甘蓝（broccoli)、甘蓝（cabbage)、胡萝h花挪菜、芹菜、白菜（化inese cabbage)、棉、黄瓜、茄子、窝宦、甜瓜(melon)、魏豆、胡椒、花生、马铃馨、南瓜、萝h油菜巧、 渡菜、大豆、南瓜、甜菜、向日葵、烟草、番茄和西瓜。本方法中可用的单子叶植物的非限制性 例子包括玉米、洋葱、稻、高梁、小麦、黑麦、泰(millet)、甘薦、燕麦、黑小麦、柳枝稷和草地 草（turfgrass)。
[0127] 可任何方式使用或栽培依照本发明的转基因植物，其中化P和/或感兴趣的核 酸分子是想要的。因而，可W通过本领域技术人员已知的任何方法工程化改造为具有一种 或多种期望的性状