一种脂肽类生物表面活性剂的制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种脂肽类生物表面活性剂的制备方法，所采用的菌株为耐盐短杆菌Y?1?4(Brevibacterium halotolerans)，保藏编号为CGMCC No.8823，所用培养基以廉价的蔗糖糖蜜为碳源，玉米浆为氮源，加以其它磷源和无机盐等营养元素，发酵后经酸沉淀、有机溶剂萃取等步骤，制得脂肽类生物表面活性剂；所得的脂肽类生物表面活性剂的临界胶束浓度为21.512mg/L，可以将蒸馏水的表面张力值从72mN/m(25℃)降低到28mN/m以下；该法生产脂肽生物表面活性剂所需原料廉价且易得；本发明丰富了脂肽生物表面活性剂产生菌的种类，廉价原料降低了脂肽的生产中成本，使生物表面活性剂得到更为广泛的应用成为一种可能。
【专利说明】
一种脂肽类生物表面活性剂的制备方法
技术领域
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体涉及一种脂肽类生物表面活性剂的制备方法。
【背景技术】
[0002] 脂肽类生物表面活性剂是由微生物产生的环境友好型表面活性化合物的一类，与 化学合成的表面活性剂相比，除共有特性外，还具有无毒或低毒，环境相容性好，可生物降 解，不会造成再污染等诸多优势，可利用廉价农副产品进行发酵生产，用于生物环境治理， 具有更强的表面活性和乳化能力，在极端温度、pH和盐浓度下仍保持高度的稳定性，有些还 具有抗菌，抗病毒，抗肿瘤等生理活性。脂肽类生物表面活性剂在石油化工、环境保护、食品 工业、洗涤剂、化妆品、医药等领域有重要的应用前景。
[0003] 脂肽类生物表面活性剂一般是由芽孢杆菌产生的刺激代谢产物，能产生脂肽类表 面活性剂的菌株中，研究最多是枯草芽孢杆菌，另外还有解淀粉芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌 等。除细菌外，有些酵母和霉菌也可以产生脂肽类表面活性剂。
[0004] 目前生物表面活性剂还未规模化生产和商业化，主要原因原料成本过高，发酵周 期长，分离纯化工艺复杂等。现在国内外的研究工作的主要目标就是降低生产成本，需要开 展的工作主要为选育优良生产菌株，选择廉价原料为培养基，选用简便的分离纯化方法，以 降低生物表面活性剂的生产成本。
【发明内容】
[0005] 针对现有技术中存在的原料成本过高，发酵周期长，分离纯化工艺复杂等技术问 题，本发明的目的在于提供一种利用工业废料发酵生产脂肽生物表面活性剂的方法，该方 法具有工艺简单，发酵周期短，减少环境污染，成本低，适合工业化生产。
[0006] 为了实现本发明的技术目的，本发明采取的技术方案如下：
[0007] -种脂肽类生物表面活性剂的制备方法，采用分类命名为耐盐短杆菌Y-1-4 (Brevibacterium halotolerans)菌株进行发酵培养得到脂肽类生物表面活性剂产品，该 菌株于2014年2月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编 号为:CGMCC No.8823。
[0008] 进一步的，所述的一种脂肽类生物表面活性剂的制备方法，具体步骤为：
[0009] (a)取诱变后筛选获得的耐盐短杆菌Y-1-4菌株，接种于LB斜面培养基中进行活 化；
[0010] (b)取步骤a获得的菌体用于扩大培养，扩大培养条件为30~35°C、120rpm振荡培 养18_20h，获种子液；
[0011] (c)按照体积百分比3%~5%的接种量将步骤b获得菌体接种于发酵培养基中，控 制培养基的初始pH为6.5-7.5，培养温度25-35°C，摇床转速120-160r/min，培养时间18- 24h；
[0012] (d)利用步骤c所得的耐盐短杆菌Y-1-4发酵液经去细胞、酸沉淀、有机溶剂萃取步 骤，制得脂肽类生物表面活性剂。
[0013] 进一步的，所述发酵培养基以葡萄糖、乳糖、蔗糖、可溶性淀粉、麦芽糖、大豆糖蜜、 甘油、蔗糖糖蜜中的一种或多种为碳源；
[0014] 进一步的，所述发酵培养基以豆饼粉、蛋白胨、牛肉粉、玉米浆、酵母粉、硝酸铵、硫 酸铵、尿素的一种或多种为氮源。
[0015] 更进一步的，所述发酵培养基以淀粉和蔗糖糖蜜为碳源；以酵母粉、蛋白胨和玉米 浆为氮源，基于发酵成本，选择1-3%的蔗糖糖蜜作为碳源，2-5%的玉米浆作为氮源。
[0016] 进一步的，所述发酵培养基以K2HP〇4、NaH2P〇4、MgS〇4、FeS〇4、CaC〇3、CaCl2、KClS NaCl中的一种或多种为无机盐及营养元素。
[0017] 更进一步的，所述无机盐及营养元素的用量为:K2HP〇4 2-5g/L、NaH2P〇4 2-5g/L、 MgS〇4 0.01-0.3g/L、FeS〇4 0.01-0.3g/L、NaCl 4-6g/L。
[0018] 进一步的，所述步骤(a)中耐盐短杆菌Y-1-4的培养基组分和培养条件为：自来水 1000mL，蔗糖糖蜜2%，玉米浆3.2%，K2HP〇4 5g/L，NaH2P〇4 5g/L，MgS〇4 0.03g/L，FeS〇4 0.05g/L，NaCl 6g/L，装液量70mL/250mL，接种量为5 %，培养基的初始pH值为7.2，培养温度 32 °C，摇床转速120r/min，培养时间24h。
[0019] 进一步的，所述步骤(d)中脂肽类生物表面活性剂的提取方法为:将耐盐短杆菌Y- 1-4的发酵液离心取上清液，用盐酸调pH到3-4,保持温度为4°C静置过夜，离心弃上清液，所 得沉淀用体积比氯仿：甲醇= 2-1:1的萃取剂萃取三次，合并有机相，旋转蒸发，获得脂肽类 生物表面活性剂粗品。
[0020] 进一步的，所述的菌株在发酵制备脂肽类生物表面活性剂中的应用。
[0021] 本发明的有益效果：
[0022] 1、本发明公开了一株产脂肽类生物表面活性剂的耐盐短杆菌的培养方法，利用耐 盐短杆菌Y-1-4发酵制备脂肽类生物表面活性剂，所得的脂肽类生物表面活性剂的临界胶 束浓度为21.512mg/L，可以将蒸馏水的表面张力值从72mN/m(25°C)降低到28mN/m以下；为 脂肽类生物表面活性剂的微生物制备增加了一类菌株。
[0023] 2、本发明采用蔗糖糖蜜和玉米浆为主要原料发酵生产脂肽表面活性剂的工艺技 术，原料廉价且易得，实现工业废弃物的资源化利用，减少环境污染治理费用，降低了脂肽 表面活性剂的生产成本，使生物表面活性剂得到更为广泛的应用成为一种可能。
[0024] 3、该工艺不需要复杂的设备，发酵周期短，且发酵过程简单易行，有利于脂肽表面 活性剂的开发、应用和推广。
【附图说明】
[0025] 图1为生物表面活性剂的临界胶束浓度图。
【具体实施方式】 [0026] 实施例1:
[0027] 菌株筛选
[0028] 本发明的耐盐短杆菌Y-1-4是利用下述的方法进行筛选的，具体步骤如下：
[0029] (1)把从土壤中已经分离纯化的317株细菌，分别点种在血平板上，30-37 °C下培养 12-24h〇
[0030] (2)选择步骤(1)中溶血圈大的菌株进行排油圈试验。
[0031] (3)步骤(1)中的血平板购自北京陆桥技术股份有限公司。
[0032] (4)步骤(2)中所采用的排油圈实验的具体步骤:取直径为9cm的培养皿，加入20mL 的蒸馏水，在水中央滴入200yL液体石蜡，慢慢形成一薄层油膜，在液体石蜡中间慢慢加入 l〇yL上清液，测定排油圈的直径。其中排油圈最大（7.5cm)的菌株就是耐盐短杆菌 (Brevibacterium halotolerans)Y-1-4〇
[0033] (5)选择步骤(4)中排油圈直径大的菌株进行乳化试验和表面张力测定。
[0034] (6)步骤(5)中乳化试验的具体步骤:取带刻度试管，加入5mL发酵上清液和5mL玉 米油，高速振荡2min，室温静置24h，测定乳化指数。乳化指数=乳化层的高度/液体总高度 X100%〇
[0035] (7)步骤（5)中表面张力的测定方法：取20mL左右的发酵上清液于小烧杯中，用 JK99C全自动张力仪(上海中晨数字技术设备有限公司）测定表面张力。表面张力最小的菌 株就是我们需要的菌株。
[0036] (8)步骤(5)中的发酵培养基为Luria-Bertani(LB)液体培养基。
[0037] 实施例2:
[0038] 耐盐短杆菌(Brevibacterium halotolerans)Y-l_4对碳源的利用
[0039] 耐盐短杆菌Y-1-4可以利用各种碳源来生产脂肽类生物表面活性剂，主要有葡萄 糖、乳糖、蔗糖、可溶性淀粉、麦芽糖、大豆糖蜜、甘油、蔗糖糖蜜。其它组分为:酵母粉3g/L、 K2HPO4 3g/L、NaH2P〇4 3g/L、MgS〇4 0.1g/L、FeS〇4 0.05g/L、NaCl 5g/。碳源浓度为2%L，装 样量为50mL/250mL锥形瓶，接种量为4%，培养温度30°C，摇床转速160rpm。结果见下表1。 [0040]表1为不同碳源对应的生物表面活性剂粗重表
[0041]
[0042] 实施例3:
[0043] 耐盐短杆菌(Brevibacterium halotolerans)Y-l_4对氮源的利用
[0044] 耐盐短杆菌Y-1-4可以利用各种氮源来生产脂肽类生物表面活性剂，主要有豆饼 粉、蛋白胨、牛肉粉、玉米浆、酵母粉、硝酸铵、硫酸铵、尿素。其它组分为：蔗糖糖蜜20g/L、 K2HPO4 3g/L、NaH2P〇4 3g/L、MgS〇4 0.05g/L、FeS〇4 0.1g/L、NaCl 4g/L。氮源浓度为3g/L，装 样量为50mL/250mL锥形瓶，接种量为5%，培养温度28°C，摇床转速140rpm。结果见下表2。
[0045] 表2为不同氮源对应的生物表面活性剂粗重表
[0046]
[0047] 实施例4:
[0048] 耐盐短杆菌(1^^￥让&(^61'；[1111111&101:016瓜118)￥-1-4发酵生产生物表面活性剂
[0049] 从固体斜面挑取一环耐盐短杆菌Y-1-4菌体，接种于LB液体培养基中，32°C， 120rpm振荡培养18h，获种子液。按5%接种量将种子液转接于发酵培养基中，32°C，120rpm 振荡培养24h。
[0050] 其中发酵培养基：蔗糖糖蜜 10_30g/L，玉米浆2〇-50g/L，K2HP〇4 2-5g/L，NaH2P〇4 2-5g/L，MgS〇4 0.01_0.3g/L，FeS〇4 0.01_0.3g/L，NaCl 4-6g/L。
[00511脂肽类生物表面活性剂的提取:将耐盐短杆菌Y-1-4的发酵液4°C，lOOOOrpm离心 lOmin。取上清液，用6N的盐酸调pH到3.0，4°C冰箱静置过夜。随后4°C，8000rpm离心10min， 弃上清，取沉淀。沉淀用等体积氯仿：甲醇(体积比2:1)萃取三次。合并有机相，旋转蒸发，获 得脂肽类生物表面活性剂粗品。
[0052] 临界胶束浓度(CMC)的测定:采用铂片法常温下(25°C)测定，将lg/L的脂肽类生物 表面活性剂溶液按比例稀释至不同浓度，测定其表面张力；以表面活性剂浓度的对数为横 坐标，所测得的表面张力值为纵坐标绘制表面张力-浓度对数曲线（如图1所示），曲线拐点 所对应的表面活性剂浓度是该表面活性的CMC。由图1和表3可以看出，所得脂肽类生物表面 活性剂的临界胶束浓度为21.135mg/L，可以将蒸馏水的表面张力值从72mN/m(25°C )降低到 28mN/m以下。
[0053] 表3为不同生物表面活性剂浓度对应的表面张力表
[0054]
[0055]
[0056] 以上所述并非是对本发明的限制，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来 说，在不脱离本发明实质范围的前提下，还可以做出若干变化、改型、添加或替换，这些改进 和润饰也应视为本发明的保护范围。
【主权项】
1. 一种脂肽类生物表面活性剂的制备方法，其特征在于，采用分类命名为耐盐短杆菌 Y-1-4(Brevibacterium halotolerans)菌株进行发酵培养得到脂肽类生物表面活性剂产 品，该菌株于2014年2月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保 藏编号为:CGMCC No.8823。2. 根据权利要求1所述的一种脂肽类生物表面活性剂的制备方法，其特征在于，具体步 骤为： (a) 取诱变后筛选获得的耐盐短杆菌Y-1-4菌株，接种于LB斜面培养基中进行活化； (b) 取步骤a获得的菌体用于扩大培养，扩大培养条件为30~35°C、120rpm振荡培养18-20h，获种子液； (c) 按照体积百分比3%~5%的接种量将步骤b获得菌体接种于发酵培养基中，控制培 养基的初始pH为6.5-7.5，培养温度25-35°C，摇床转速120-160r/min，培养时间18-24h; (d) 利用步骤c所得的耐盐短杆菌Y-1-4发酵液经去细胞、酸沉淀、有机溶剂萃取步骤， 制得脂肽类生物表面活性剂。3. 根据权利要求2所述的一种脂肽类生物表面活性剂的制备方法，其特征在于，所述发 酵培养基以葡萄糖、乳糖、蔗糖、可溶性淀粉、麦芽糖、大豆糖蜜、甘油、蔗糖糖蜜中的一种或 多种为碳源。4. 根据权利要求2所述的一种脂肽类生物表面活性剂的制备方法，其特征在于，所述发 酵培养基以豆饼粉、蛋白胨、牛肉粉、玉米浆、酵母粉、硝酸铵、硫酸铵、尿素的一种或多种为 氮源。5. 根据权利要求2-4任意所述的一种脂肽类生物表面活性剂的制备方法，其特征在于， 所述发酵培养基以淀粉和蔗糖糖蜜为碳源；以酵母粉、蛋白胨和玉米浆为氮源。6. 根据权利要求2所述的一种脂肽类生物表面活性剂的制备方法，其特征在于，所述发 酵培养基以心册〇4、恥!^〇4、]\%3〇4^63〇4、〇3〇) 3、〇3(：12、1((：1或恥(：1中的一种或多种为无机盐 及营养元素。7. 根据根据权利要求6所述的一种脂肽类生物表面活性剂的制备方法，其特征在于，所 述无机盐及营养元素的用量为:K2HP〇4 2-5g/L、NaH2P〇4 2-5g/L、MgS〇4〇 · 01 -0 · 3g/L、FeS〇40.(U-0.3g/L、NaCl 4-6g/L。8. 根据权利要求2所述的一种脂肽类生物表面活性剂的制备方法，其特征在于，所述步 骤(d)中脂肽类生物表面活性剂的提取方法为:将耐盐短杆菌Y-1-4的发酵液离心取上清 液，用盐酸调pH到3-4,保持温度为4°C静置过夜，离心弃上清液，所得沉淀用体积比氯仿：甲 醇=2-1:1的萃取剂萃取三次，合并有机相，旋转蒸发，获得脂肽类生物表面活性剂粗品。
【文档编号】C12R1/13GK105838763SQ201610308566
【公开日】2016年8月10日
【申请日】2016年5月10日
【发明人】李红芳, 李俊峰, 滕丽丽, 段效辉, 梁生康
【申请人】青岛科技大学