一种纳米甲氨蝶呤的硫酸软骨素衍生物及其制备方法、用图
【专利摘要】一种纳米甲氨蝶呤的硫酸软骨素衍生物及其制备方法、用途，涉及甲氨蝶呤衍生物的合成方法和用途技术领域。将4?(4,6?二甲氧基三嗪?2?基)?4?甲基吗啉盐酸盐溶于硫酸软骨素的水溶液，取得活化溶液，再将酸性甲氨蝶呤的水溶液与活化溶液混合，取得二次活化混合液，最后将二次活化混合液置于超纯水中透析、冻干，取得纳米甲氨蝶呤的硫酸软骨素衍生物。本发制备方法简单，成本低，产品可用于制备防治、阻止恶性肿瘤引起的溶骨性病变、治疗高血钙症、减少骨吸收的注射剂。
【专利说明】
一种纳米甲氨蝶昤的硫酸软骨素衍生物及其制备方法、用途
技术领域
[0001 ]本发明涉及甲氨蝶呤衍生物，特别涉及一种甲氨蝶呤的硫酸软骨素衍生物及其合 成方法和用途。
【背景技术】
[0002] 恶性肿瘤已经成为一类严重危害人类身心健康的疾病，给社会带来了沉重的经济 负担。我国近20年发病率上升了69%，每年新增癌症发病例220万，每五个死者中就有一个死 于癌症。随着我国物质生活水平提高带来的饮食、生活方式、工作方式、人口老龄化等问题， 癌症的发病率逐年升高。研究新的抗癌药物以及减少现有抗癌药物毒性是当前医学研究的 热点。
[0003] DNA和RNA的复制和修复需要利用四氢叶酸作为底物来完成这些重要的生物化学 反应。四氢叶酸在体内由叶酸还原酶还原叶酸来生物合成。甲氨蝶呤(MTX)是叶酸类似物， 是一类抗代谢类抗肿瘤药物。MTX可以与叶酸还原酶结合，通过竞争性抑制阻断四氢叶酸的 形成，从而抑制DNA、RNA、蛋白和胸苷酸的合成。甲氨蝶呤广泛应用于绒毛膜上皮癌、恶性葡 萄胎、各类急性白血病、各种软组织肉瘤、银肩病等。也可以作为免疫抑制剂治疗类风湿疾 病。大剂量的静脉输注甲氨蝶呤是病人化疗的重要治疗方案之一，但是大剂量的甲氨蝶呤 带来的骨髓抑制，肝功能损害，肾功能损害以及黏膜损害仍然给临床带来了问题。
[0004] 下式为甲氨蝶呤的结构式：
硫酸软骨素是(CS)是一类硫酸化的糖胺聚糖，广泛分布于动物组织的细胞外基质和细 胞表面，主要分布于软骨、骨、血管壁、肌腱和肌膜中。由D-葡萄糖醛酸和N-乙酰-D-半乳糖 以1，3糖苷键形成二糖单位，相对分子质量一般为25000~30000。就硫酸化程度、硫酸基和 两种差异向异构糖醛酸再链内的分布来说，呈现高度的不均一性。硫酸软骨素与多种蛋白 质分子的相互作用。硫酸软骨素被用于治疗骨关节炎、慢性膀胱炎、增强免疫功能、治疗银 雪病、抗凝血抗血栓、抗动脉粥样硬化、保护和修复神经元、治疗慢性神精炎症，并且越来越 多的研究证明外源CS的摄入可以起到治疗癌症的作用。
[0005] 下式先硫酿餘魯麦的姑抝忒.
公开号为CN 104371009 A的专利又献提供J 一柙GnKH多肱-甲m蝶呤偶联物、其制 备方法及用途，该发明提供一种含有甲氨蝶呤的药物组合物，增加药物的靶向性。公开号为 CN 104667279 A的专利文献通过佐剂联合给药来减少甲氨蝶呤的毒性。
[0006] 但是，这些现有技术存在原料成本高，工艺制作复杂，操作要求繁琐等问题，因而 无法大规模生产。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的在于克服上述缺陷，研制一种硫酸软骨素衍生物。
[0008] 本发明硫酸软骨素衍生物是以甲氨蝶呤修饰的硫酸软骨素的纳米球，所述纳米甲 氨蝶呤的硫酸软骨素衍生物的结构式为：
上式中，m为未连上甲氨蝶呤的硫酸软骨素循环结构的量，m为20~300的整数;η为连上 甲氨蝶呤的硫酸软骨素循环结构的量，η为22~150的整数。
[0009] 本发明可制成注射剂，对防治、治疗绒毛膜上皮癌、恶性葡萄胎、各类急性白血病、 各种软组织肉瘤、银肩病等疾病方面具有疗效。本发明可以提高甲氨蝶呤在体内的通透性， 减少药物对黏膜的刺激性，并且使甲氨蝶呤缓慢释放，降低甲氨蝶呤在体内的副作用，改善 人体康复治疗水平，提高患者用药安全质量。
[0010] 本发明中所述硫酸软骨素包括硫酸软骨素 A( CS-A)、硫酸软骨素 C( CS-C)、硫 酸软骨素 D( CS-D)或硫酸软骨素 E( CS-E)中的一种。这些具体材料为硫酸软骨素的不同 取代基团。
[0011] 本发明还提出以上纳米甲氨蝶呤的硫酸软骨素衍生物的制备方法。
[0012]本发明制备方法步骤是： 1) 将4-(4,6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐溶于硫酸软骨素的水溶液中，取 得活化溶液； 2) 将酸性甲氨蝶呤的水溶液与活化溶液混合，经磁力搅拌，取得二次活化混合液； 3) 将二次活化混合液置于超纯水中透析、冻干，取得纳米甲氨蝶呤的硫酸软骨素衍生 物。
[0013] 本发明以4-(4,6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐为耦合剂，将硫酸软骨 素中活化后的羧酸钠和甲氨蝶呤中的氨基耦联成酰胺键将二者结合，以使甲氨蝶呤修饰在 硫酸软骨素上，形成纳米球。
[0014] 本发明直接通过化学方法修饰甲氨蝶呤，该甲氨蝶呤改进型药物不仅制备方法简 单，成本低，原料简单易得，对工艺要求低，可以大规模生产。
[0015] 为了在硫酸软骨素上面连上更多的甲氨蝶呤，形成的纳米粒可以包裹更多的药 物，所述硫酸软骨素和甲氨蝶呤的混合摩尔比为1:1~20。
[0016] 为了活化尽可能多的羧基基团，有利于连上更多的甲氨蝶呤，所述4-(4,6_二甲氧 基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐溶和甲氨蝶呤的混合摩尔比为1.2:1。
[0017] 为了尽可能快的透析出不需要的杂质，在透析前三次每2h换一下水，之后每4h换 一次水。
[0018] 为了活化尽可能多的羧基，所述步骤1)中，所述4-(4,6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐与硫酸软骨素的水溶液中硫酸软骨素的混合摩尔比为1.2:1。
[0019] 本发明的第三个目的是：提出纳米甲氨蝶呤的硫酸软骨素衍生物的应用，用于制 备防治、阻止恶性肿瘤引起的溶骨性病变、治疗高血钙症、减少骨吸收的注射剂。
[0020] 该注射剂可以显著降低肿瘤细胞的活力、抑制肿瘤细胞的增殖。
【附图说明】
[0021 ]图1为实施例1取得的纳米粒分散在水中的原子力图。
[0022]图2为实施例2取得的纳米粒分散在水中的原子力图。
[0023] 图3为甲氨蝶呤、甲氨蝶呤-硫酸软骨素的浓度与肿瘤细胞活力的关系图。
【具体实施方式】
[0024] 为了更加完整的介绍本发明的特点，下面结合具体实施案例进一步介绍由含氨基 的甲氨蝶呤和硫酸软骨素反应生成的新型药物及其制备方法和该药物在绒毛膜上皮癌、恶 性葡萄胎、各类急性白血病、各种软组织肉瘤、银肩病方面的应用。
[0025] -、甲氨蝶呤的硫酸软骨素衍生物的制备： 实施例1: I、将1.0 g硫酸软骨素溶于20mL超纯水。
[0026] 将0.769g的4-(4,6_二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐溶于步骤（1)得到的 溶液，活化30min。
[0027] 2、将1.2g的甲氨蝶呤溶于IOmL的超纯水，调节pH为酸性至完全溶解。
[0028] 3、将步骤(3)得到的溶液加入步骤(2)活化后的溶液中，置于磁力搅拌器搅拌反应 5h〇
[0029] 4、5h后将反应液倒入透析袋中，于超纯水中透析48h，每4h换一次水。
[0030] 5、48h后将步骤(5)所得的透析袋中溶液冻干得到所要目标产物。
[0031] 6、对目标产物分析，其结构式如下：
上式中，m为:20~300的整数;η为:22~150的整数。
[0032] 实施例2: 1、将53.2mg硫酸软骨素溶于5mL超纯水。
[0033] 2、将40.91mg的4-(4,6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐溶于步骤（1)得 到的溶液，活化30min。
[0034] 3、将63.84mg的甲氨蝶呤溶于5mL的超纯水，调节pH为酸性至完全溶解。
[0035] 4、将步骤(3)得到的溶液加入步骤(2)活化后的溶液中，置于磁力搅拌器搅拌反应 6h〇
[0036] 5、6h后将反应液倒入透析袋中，于超纯水中透析48h，每4h换一次水。
[0037] 6、48h后将步骤(5)所得透析袋中溶液冻干得到所要目标产物。
[0038] 7、对目标产物进行分析，分析其结构式如下：
上式中，m为：20~300的整数;η为：22~150的整数。
[0039]二、通过原子力显微镜验证以上两种实施例制成的产物： 如图1、2所示，两例制成的甲氨蝶呤的硫酸软骨素衍生物纳米球直径约为200nm，为纳 米级产物。
[0040] 三、应用： 1、制成纳米甲氨蝶呤的硫酸软骨素衍生物注射剂： 一种甲氨蝶呤的硫酸软骨素衍物制备成的注射剂，包括PH 7.4的磷酸缓冲盐溶液以及 分散于磷酸缓冲盐溶液的纳米甲氨蝶呤的硫酸软骨素衍生物，其中纳米甲氨蝶呤的硫酸软 骨素衍生物的浓度为lmg/ml。
[0041 ] 2、应用及验证结果： 为了验证纳米甲氨蝶呤的硫酸软骨素衍生物对肿瘤细胞的抑制作用。以Hela细胞给予 甲氨蝶呤、甲氨蝶呤-硫酸软骨素治疗48小时，观察细胞活力，并通过本领域众所周知的MTT 实验来计算细胞活力情况，得到图3结果。
[0042] 图3中，曲线"甲氨蝶呤"代表：曲线代表甲氨蝶呤不同浓度的给药量抑制肿瘤细胞 的生长情况，细胞活力越低代表抑制效果越好。
[0043] 图3中曲线"甲氨蝶呤-硫酸软骨素"代表：曲线代表甲氨蝶呤一硫酸软骨素不同浓 度的给药量抑制肿瘤细胞的生长情况，细胞活力越低代表抑制效果越好。
[0044] 由图3可以看出，采用本发明制备的纳米甲氨蝶呤的硫酸软骨素衍生物，制成纳米 甲氨蝶呤的硫酸软骨素衍生物注射剂可以显著降低肿瘤细胞的活力、抑制肿瘤细胞的增 殖。
[0045] 可见，采用本发明制成的注射剂可用于防治、阻止恶性肿瘤引起的溶骨性病变、治 疗高血钙症、减少骨吸收，或用于防治、治疗绒毛膜上皮癌、恶性葡萄胎、各类急性白血病、 各种软组织肉瘤、银肩病等疾病。
【主权项】
1. 一种纳米甲氨蝶呤的硫酸软骨素衍生物，其特征在于所述硫酸软骨素衍生物是以甲 氨蝶呤修饰的硫酸软骨素的纳米球，所述纳米甲氨蝶呤的硫酸软骨素衍生物的结构式为：上式中，m为:20~300的整数;η为:22~150的整数。2. 根据权利要求1所述纳米甲氨蝶呤的硫酸软骨素衍生物，其特征在于，所述硫酸软骨 素包括硫酸软骨素 A( CS-A)、硫酸软骨素 C( CS-C)、硫酸软骨素 D( CS-D)或硫酸软骨素 E( CS-E)中的一种。3. 如权利要求1所述纳米甲氨蝶呤的硫酸软骨素衍生物的制备方法，其特征在于包括 以下步骤： 1)将4-(4，6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐溶于硫酸软骨素的水溶液中，取 得活化溶液； 2 )将酸性甲氨蝶呤的水溶液与活化溶液混合，经磁力搅拌，取得二次活化混合液； 3)将二次活化混合液置于超纯水中透析、冻干，取得纳米甲氨蝶呤的硫酸软骨素衍生 物。4. 根据权利要求3所述纳米甲氨蝶呤的硫酸软骨素衍生物的制备方法，其特征在于所 述硫酸软骨素包括硫酸软骨素 A( CS-A)、硫酸软骨素 C( CS-C)、硫酸软骨素 D( CS-D)或 硫酸软骨素 E( CS-E)中的一种。5. 根据权利要求3或4所述纳米甲氨蝶呤的硫酸软骨素衍生物的制备方法，其特征在于 所述硫酸软骨素和甲氨蝶呤的混合摩尔比为1:1~20。6. 根据权利要求3或4所述纳米甲氨蝶呤的硫酸软骨素衍生物的制备方法，其特征在于 所述4-(4,6_二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐溶和甲氨蝶呤的混合摩尔比为1.2: 1〇7. 根据权利要求3所述纳米甲氨蝶呤的硫酸软骨素衍生物的制备方法，其特征在于在 透析过程中每2~6h换一次水。8. 根据权利要求3所述纳米甲氨蝶呤的硫酸软骨素衍生物的制备方法，其特征在于所 述步骤1)中，所述4-(4,6_二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐与硫酸软骨素的水溶液 中硫酸软骨素的混合摩尔比为1.2:1。9.如权利要求1所述纳米甲氨蝶呤的硫酸软骨素衍生物的应用，用于制备防治、阻止恶 性肿瘤引起的溶骨性病变、治疗高血钙症、减少骨吸收的注射剂。
【文档编号】A61P3/14GK105859912SQ201610288963
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2016年5月5日
【发明人】朱沛志, 王进宇, 刘冠雄, 张文静
【申请人】扬州大学