一种环磷腺苷的药物组合物及其医药用图
【专利摘要】本发明公开了一种环磷腺苷的药物组合物及其医药用途，本发明提供的环磷腺苷的药物组合物中含有环磷腺苷和一种从五味子的干燥果实中分离得到的结构新颖的天然产物化合物（Ⅰ），环磷腺苷和该天然产物化合物（Ⅰ）单独作用时，对黑色素瘤的治疗效果较弱；二者联合作用时，对黑色素瘤的治疗效果显著提高，可以开发成治疗黑色素瘤的药物，与现有技术相比具有突出的实质性特点和显著的进步。
【专利说明】
一种环磷腺苷的药物组合物及其医药用途
技术领域
[0001] 本发明属于生物医药领域，涉及环磷腺苷的新用途，具体涉及一种环磷腺苷的药 物组合物及其对黑色素瘤的治疗作用。
【背景技术】
[0002] 为蛋白激酶致活剂，系核苷酸的衍生物。它是在人体内广泛存在的一种具有生理 活性的重要物质，由三磷酸腺苷在腺苷环化酶催化下生成，能调节细胞的多种功能活动。作 为激素的第2信使，在细胞内发挥激素调节生理机能和物质代谢作用，能改变细胞膜的功 能，促使网织肌浆质内的钙离子进入肌纤维，从而增强心肌收缩，并可促进呼吸链氧化酶的 活性，改善心肌缺氧，缓解冠心病症状及改善心电图。
[0003] 环磷腺苷为参与调节细胞功能的第二信使物质，其作用非常广泛，注射大剂量的 环磷腺苷，能使心肌收缩力增强，引起血压升高，心输出量增高。并能舒张平滑肌、扩张冠状 动脉血管、改善肝功能、促进神经再生、抑制皮肤外层上皮细胞分裂及转化异常细胞的功 能、促进呼吸链氧化酶的活性及改善心肌缺氧等。
[0004] 黑色素瘤，又称恶性黑色素瘤，是来源于黑色素细胞的一类恶性肿瘤，常见于皮 肤，亦见于黏膜、眼脉络膜等部位。黑色素瘤是皮肤肿瘤中恶性程度最高的瘤种，容易出现 远处转移。早期诊断和治疗因而显得尤为重要。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供一种环磷腺苷的药物组合物，该药物组合物中含有环磷腺 苷和一种从草本中分离得到的结构新颖的天然产物，环磷腺苷和该天然产物可以协同治疗 黑色素瘤。
[0006] 本发明的上述目的是通过下面的技术方案得以实现的： 一种具有下述结构式的化合物（I)，
[0007] 一种环磷腺苷的药物组合物，包括环磷腺苷、如上所述的化合物a)和药学上可以 接受的载体。
[0008]如上所述的化合物（I)的制备方法，包含以下操作步骤：（a)将五味子的干燥果实 粉碎，用75~85%乙醇热回流提取，合并提取液，浓缩至无醇味，依次用石油醚、乙酸乙酯和水 饱和的正丁醇萃取，分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；（b)步骤(a) 中正丁醇取物用大孔树脂除杂，先用15%乙醇洗脱8个柱体积，再用70%乙醇洗脱12个柱体 积，收集70%洗脱液，减压浓缩得70%乙醇洗脱浓缩物；（c)步骤(b)中70%乙醇洗脱浓缩物用 正相硅胶分离，依次用体积比为70:1、35:1、15:1和5:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到4个 组分；（d)步骤(c)中组分4用正相硅胶进一步分离，依次用体积比为8:1、5:1和2:1的二氯甲 烷-甲醇梯度洗脱得到3个组分;（e)步骤(d)中组分2用十八烷基硅烷键合的反相硅胶分离， 用体积百分浓度为75%的甲醇水溶液等度洗脱，收集9~15个柱体积洗脱液，洗脱液减压浓缩 得到化合物(I)。
[0009] 进一步地，步骤(a)中，用80%乙醇热回流提取，合并提取液。
[0010]进一步地，所述大孔树脂为D101型大孔吸附树脂。
[0011] 如上所述的化合物(I)在制备治疗黑色素瘤的药物中的应用。
[0012] 如上所述的环磷腺苷的药物组合物在制备治疗黑色素瘤的药物中的应用。
[0013]本发明的优点： 本发明提供的环磷腺苷的药物组合物中含有环磷腺苷和一种从五味子中分离得到的 结构新颖的天然产物，环磷腺苷和该天然产物单独作用时，对黑色素瘤的治疗效果较弱;二 者联合作用时，对黑色素瘤的治疗效果显著提高，可以开发成治疗黑色素瘤的药物。本发明 与现有技术相比具有突出的实质性特点和显著的进步。
【具体实施方式】
[0014] 下面结合实施例进一步说明本发明的实质性内容，但并不以此限定本发明保护范 围。尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对 本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
[0015] 实施例1:化合物(I)分离制备及结构确证 试剂来源：乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、二氯甲烷为分析纯，购自上海凌峰化学试 剂有限公司，甲醇，分析纯，购自江苏汉邦化学试剂有限公司。
[0016] 分离方法：（a)将五味子的干燥果实（5kg)粉碎，用80%乙醇热回流提取（20LX 3 次），合并提取液，浓缩至无醇味(4L)，依次用石油醚(4L X 3次）、乙酸乙酯(4L X 3次)和水饱 和的正丁醇(4LX3次)萃取，分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；（b) 步骤(a)中乙酸乙酯萃取物用D101型大孔树脂除杂，先用15%乙醇洗脱8个柱体积，再用70% 乙醇洗脱12个柱体积，收集70%洗脱液，减压浓缩得70%乙醇洗脱浓缩物；（c)步骤(b)中70% 乙醇洗脱浓缩物用正相硅胶分离，依次用体积比为70 :1 (8个柱体积）、35 :1 (8个柱体积）、 15:1(8个柱体积)和5:1(10个柱体积)的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到4个组分；（d)步骤(c) 中组分4用正相硅胶进一步分离，依次用体积比为8:1 (8个柱体积）、5:1 (10个柱体积)和2:1 (5个柱体积)的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到3个组分;（e)步骤(d)中组分2用十八烷基硅烷 键合的反相硅胶分离，用体积百分浓度为75%的甲醇水溶液等度洗脱，收集9~15个柱体积洗 脱液，洗脱液减压浓缩得到化合物（I) (295mg，HPLC归一化纯度大于98%)。
[0017] 结构确证:黄色粉末;册431-1^显示[1+!1]+为111/2 395.1921，结合核磁特征可得 分子式为C23H26N2〇4，不饱和度为12。核磁共振氢谱数据δ Η(ppm，DMSO-?，500MHz ) : H-3 (4.13， d,/=4.9Hz),H-5a(3.12,dd,/=11.2,6.2Hz),H-5b(2.74,dd,/=11.2,4.0Hz),H-6(6.02,dd, /=6.2,4.0Hz),H-10(6.84,d,/=8.7Hz),H-ll(7.32,t,/=8.7Hz),H-12(7.13,d,/=8.7Hz), H-14a(2.23，m)，H-14b(l ·92，(Η，/=12·2,3·5Ηζ)，Η-15(3· 13，dtJ=12.2,4.2Hz)，H-17 (7.40,m),H-18(l.09,t,/=8.8Hz),H-19(3.76,q,/=8.8Hz,2H),H-21(5.62,s),9-0Me (3.81，8)，17-<116(3.84,8)，22-(116(3.62,8);核磁共振碳谱数据3。( ？?111，0150-办，1251抱）： 164.2(C，2-C)，50.2(CH，3-C)，47.2(CH2,5-C)，124.3(CH，6-C)，130.7(C，7-C)，113.2(C，8-C)，159.3(C，9-C)，112.9(CH，10-C)，130.2(CH，11-C)，117.8(CH，12-C)，148.3(C，13-C)， 26.6(CH2，14-C)，31.3(CH，15-C)，110.3(C，16-C)，160.9(CH，17-C)，13.4(CH 3，18-C)，61.2 (CH2，19-C)，99.6(C，20-C)，135.2(CH，21-C)，168.1(C，22-C)，55.8(9-0Me)，61.3(17-OMehSOJUS-OMeXUV谱图中的最大吸收带222nm、347nm与394nm表明含有吲哚片段。氢谱 核磁数据表明：该结构中存在一组ABX偶合特征的质子信号δΗ6.84( lH，d J=8.7Hz，H-10)， 7.32(t，/=8.7Hz，H-l 1)与7.13(d，/=8.7Hz，H-l2)。此外，氢谱与碳谱核磁数据表明化合物 结构中含有一个甲氧基丙烯酸甲酯基片段，一个乙基片段，一个甲氧基苯片段，这些信息 提示该化合物可能是9-甲氧基-Corynanthe类单砲生物碱。HMBC谱中，Η2-19与C-20和C-21 的相关性表明乙基片段连接在C-20位上。在Corynanthe类单砲生物碱的生物合成途径中H-15总是处在α位，据R0ESY谱分析，H-15与H_14b存在相关信号，说明H_14b也为α构型;此外， R0ESY中的Η-3与H-14a的相关信号归属了 Η-3为β构型。综合氢谱、碳谱、HMBC谱和R0ESY谱， 以及文献关于相关类型核磁数据，可基本确定该化合物如下所示，立体构型进一步通过ECD 试验确定，理论值与实验值基本一致。
[0018]
[0019]实施例2:对黑色素瘤的治疗作用 一、材料和仪器 人Α375黑色素瘤细胞株由第三军医大学赠。化合物（I)自制，制备方法见实施例1， HPLC归一化纯度大于98%<^ΜΕΜ培养基、0.25%胰酶购自美国Gibco公司。MTT (3-(4,5-二 甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐；四甲基偶氮唑蓝）、DMS0(二甲基亚砜）、BrdU购自美 国Sigma公司。鼠抗BrdU多克隆抗体购自美国ABcam公司。山羊抗鼠二抗购自美国Cell signaling公司。Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒购自美国Promega公司。
[0020]恒温C02培养箱，普通冰箱，-80度冰箱均为美国Forma公司产品。超净工作台（中国 苏州净化工程公司）。倒置显微镜，倒置荧光显微镜(Olympus公司）。电热恒温培养箱（中国 上海跃进医疗器械厂）。自动酶标仪（日本Wako公司）。紫外分光光度仪(美国Beckman公司）。 J6-HC高速离心机(美国Beckman公司）。低温微量离心机(德国Eppendorf公司）。振荡摇床 (美国Forma公司）。
[0021]二、试验方法 1、细胞培养 1.1细胞复苏 将冻存在液氮罐中的A375黑色素瘤细胞取出，迅速放入37°C的温水中，轻轻摇动使 其尽快融化(大约lmin)。然后吸出细胞悬液，加入到已加有2mL培养基的离心管中，轻轻吹 打混匀，800r/min，离心5min，弃去上层培养基。用含有10%FBS和1%的青霉G/链霉素的 DMEM培养基8mL制成细胞悬液后，接种至10cm培养盘中。然后置于5% C02、37°C恒温培养箱 中进行培养。
[0022] 1.2细胞传代 显微镜下观察细胞融合度达80%_90%时即可进行传代。先用2mL PBS洗涤细胞2次，然后 加入0.25%的胰酶lmL。轻轻水平摇动培养盘，使消化液能覆盖细胞的表面，然后置于37°C 温箱中消化约lmin。置于显微镜下见细胞变圆回缩，然后迅速加入lmL含有FBS的培养基终 止消化。轻轻吹打至细胞分散均匀，然后根据细胞密度按照1:2或1:3传代，重新接种于 新的培养盘中，置于5% C02、37°C恒温培养箱中培养。
[0023] 1.3细胞冻存 取1盘处于对数生长期的细胞，胰酶消化并收集到离心管中，l〇〇〇r/min离心5min，弃 上清。然后加入lmL冻存液，轻轻吹散细胞制成细胞悬液，将细胞悬液加入到1.5mL的冻 存管中。在冻存管上标明细胞的名称，保存时间，保存者的姓名。先将冻存管放入4°C冰箱， 放置约30min。接着置于-20°C冰箱，放置约2h。然后放于-80°C超低温冰箱中放置过夜。第 二天将冻存的细胞置于液氮罐中长期保存。
[0024] 2、细胞计数法绘制细胞生长曲线 (1) 取对数生长期A375黑色素瘤细胞，计数，调整细胞密度为2 X 104/mL。 (2) 将细胞悬液接种于12孔板中，1.5mL/孔。 (3) 12h后，待细胞贴壁，换lmL无血清DMEM培养基，并分别用5ymol/L环磷腺苷、5μπιο1/ L化合物（I)、2.5ymol/L环磷腺苷与2.5ymol/L化合物（I)组合物、DMS0【对于DMS0稀释的药 物，控制DMS0浓度在1/1000以下，确保对细胞无害】处理，每组细胞设3个平行孔，置于5% C02、37。。恒温培养箱中进行培养。
[0025] (4)分别于0h、24h、48h、72h终止培养，收集各组细胞，加0.25%胰蛋白酶消化，离 心，重悬。
[0026] (5 )细胞计数：吸取细胞混悬液1 OyL，加入等体积的台酚蓝区分活细胞，吸取1 OyL 混合液轻轻加入细胞计数板凹槽中，保证无空隙和气泡。倒置显微镜下，计数周边四个大方 格内的细胞数，代入公式:原细胞混悬液浓度(细胞数/mL)=(4个大方格的细胞数/4) X104 X稀释倍数。
[0027] (6)计算活细胞数目，绘制细胞生长曲线。 3、MTT法检测细胞增殖 (1)取对数生长期的A375细胞，消化，离心，重悬，计数，调整细胞悬液中细胞的密度 为 2X104/mL。
[0028] (2)将各组细胞悬液接种于96孔培养板中，200yL每孔，每组细胞3个平行孔，同时 设空白对照孔（只加入培养基）。
[0029] (3)12h待细胞贴壁后，换200yL无血清DMEM培养基，并分别用5ymol/L环磷腺 苷、5μηιο 1/L化合物（I)、2.5μηιο 1/L环磷腺苷与2.5μηιο 1/L化合物（I)组合物、DMS0处理。 [0030] (4)分别于0、1、2、3、4天终止培养。
[0031] (5)向每孔加入浓度为5mg/mL的四甲基偶氮唑蓝(MTT)20yL继续培养细胞4h。
[0032] (6)吸弃各小孔内的培养基，加入200yL DMS0,在微振荡器上振荡lOmin，使结晶 物充分溶解。
[0033] (7)以空白对照孔调零，采用自动酶标仪测定各孔570 nm处的吸光光度值(0D 值），以对应的0D值表示细胞增殖能力，各组取3个平行孔的平均值，以时间为横轴，以各 吸光度值为纵轴绘制细胞生长曲线。
[0034] 4、统计分析 应用SPSS 18.0统计分析软件，采用两独立样本t检验及单因素方差分析进行数据 分析，数据用Z ±S表示，P〈0.05为有统计学意义。
[0035]三、结果及结论 1、 细胞形态观察及计数结果 细胞形态观察及计数显示，环磷腺苷与化合物（I)组合物处理A375细胞48h、72h后，活 细胞数显著降低，抑制效果显著优于环磷腺苷或化合物（I)单独作用48h或72h，差异具有统 计学意义(P<〇.〇5)。
[0036] 结果见表1。
[0037] 表1对A375细胞增殖的影响(细胞计数法，单位：Xl04/mL) (Z土S，n=3)
2、 MTT法实验结果 MTT结果显示，环磷腺苷或化合物（I)单独作用、环磷腺苷与化合物（I)组合物组合作用 均能抑制A375细胞增殖，且环磷腺苷与化合物（I)组合作用时的抑制效果显著优于环磷腺 苷或化合物(I)单独作用的抑制效果(P<〇.05)。
[0038] 结果见表2。
[0039] 表2对A375细胞增殖的抑制(MTT法，0D570) (Z土 S，n=3)
结论:环磷腺苷与化合物（I)的组合物可以显著抑制A375细胞的增殖，其抑制作用显著 高于环磷腺苷或化合物（I)单独对A375细胞的抑制。环磷腺苷与化合物（I)之间存在协同作 用。
[0040]上述实施例的作用在于说明本发明的实质性内容，但并不以此限定本发明的保护 范围。本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换， 而不脱离本发明技术方案的实质和保护范围。
【主权项】
1. 一种具有下述结构式的化合物（I)，2. -种环稱腺巧的药物组合物，其特征在于：包括环憐腺巧、如权利要求1所述的化合 物(I)和药学上可W接受的载体。3. 权利要求1所述的化合物（I)的制备方法，其特征在于，包含W下操作步骤：（a)将五 味子的干燥果实粉碎，用75~85%乙醇热回流提取，合并提取液，浓缩至无醇味，依次用石油 酸、乙酸乙醋和水饱和的正下醇萃取，分别得到石油酸萃取物、乙酸乙醋萃取物和正下醇萃 取物；（b)步骤(a)中正下醇取物用大孔树脂除杂，先用15%乙醇洗脱8个柱体积，再用70%乙 醇洗脱12个柱体积，收集70%洗脱液，减压浓缩得70%乙醇洗脱浓缩物；（C)步骤(b)中70%乙 醇洗脱浓缩物用正相硅胶分离，依次用体积比为70:1、35:1、15:1和5:1的二氯甲烧-甲醇梯 度洗脱得到4个组分；（d)步骤(C)中组分4用正相硅胶进一步分离，依次用体积比为8:1、5:1 和2:1的二氯甲烧-甲醇梯度洗脱得到3个组分；（e)步骤(d)中组分2用十八烷基硅烷键合的 反相硅胶分离，用体积百分浓度为75%的甲醇水溶液等度洗脱，收集9~15个柱体积洗脱液， 洗脱液减压浓缩得到化合物(I)。4. 根据权利要求3所述的化合物（I)的制备方法，其特征在于:步骤(a)中，用80%乙醇热 回流提取，合并提取液。5. 根据权利要求3所述的化合物（I)的制备方法，其特征在于:所述大孔树脂为DlOl型 大孔吸附树脂。6. 权利要求1所述的化合物（I)在制备治疗黑色素瘤的药物中的应用。7. 权利要求2所述的环憐腺巧的药物组合物在制备治疗黑色素瘤的药物中的应用。
【文档编号】A61P35/00GK105906626SQ201610321228
【公开日】2016年8月31日
【申请日】2016年5月16日
【发明人】徐珍
【申请人】苏州毕诺佳医药技术有限公司