芳香环丙基胺类化合物、其药学上可接受的盐、其制备方法及其用图
【专利摘要】本发明涉及一种结构如通式(I)所示的芳香环丙基胺类化合物及其药学上可接受的盐，及其该类化合物的制备方法和该类化合物在制备预防或治疗耳聋的药物中的用途。其中，本发明所涉及的通式(I)中的R1、R2、R3、R4和R5如说明书和权利要求中所定义。
【专利说明】
芳香环丙基胺类化合物、其药学上可接受的盐、其制备方法及 其用途
技术领域
[0001] 本发明设及医药技术领域，具体而言，本发明设及一种具有耳聋防治作用的芳香 环丙基胺类化合物、其药学上可接受的盐、其制备方法及其在制备预防和治疗耳聋的药物 中的用途。
【背景技术】
[0002] 耳聋是高发病率的人类感官或功能缺陷性疾病。耳毒性药物是临床上造成听力损 失或障碍的重要原因，同时也是临床上儿童听力损失或障碍的重要原因。由于内耳毛细胞 损伤后缺乏再生能力，并且毛细胞的损伤会导致与其相连的螺旋神经节神经元退化，因此， 毛细胞及螺旋神经节神经元损伤保护及其机制的研究在耳聋防治中尤为重要。
[0003] 目前耳毒性药物所致毛细胞及螺旋神经节神经元的损伤保护研究主要集中在W 下几个方面:1)减轻氧化应激反应损伤，如抗氧化剂和自由基清除剂等;2)抑制调亡信号转 导通路，如JNK信号通路、X连锁调亡抑制蛋白（X-Iinked inhibitor of apoptosis proteins，XIAP)等；3)表观遗传学调控，如非编码微小RNA(miRNA)调控、DNA甲基化及组蛋 白调控等。国内在耳毒性药物损伤听觉保护研究方面已经取得了一定成果。薬树生等研究 表明，TrkB受体激动剂可W保护螺旋神经节神经元抵抗庆大霉素损伤(Yu Q,化ang Q,Liu X,Wang Y,Li H,Gong S et al. Protection of spiral ganglion neurons from degeneration using small-molecule TrkB receptor agonists. The Journal of neuroscience，2013; 33:13042-13052.)。李华伟等研究表明，过表达XIAP能够使耳蜗毛细 胞抵抗新霉素造成的耳毒性损伤（Sun S，Sun M，Zhang Y，Cheng C，Waqas M，化H，He Y，Xu B,Wang L,Wang J, Yin S,Chai R, Li H. In vivo overexpression of X-I inked inhibitor of apoptosis protein protects against neomycin-induced hair cell loss in the apical turn of the cochlea during the ototoxic-sensitive period.Frontiers in cellular neuroscience 2014,8:248.)。
[0004] 近年来，表观遗传学调控是分子生物学领域研究的热点，运种调控反映了环境-基 因-表型的相互作用，对于维持细胞稳定性具有重要意义。研究发现，表观遗传调控在生物 早期发育、胚胎干细胞分化、神经系统发育及肿瘤发生发展过程中起着重要作用。组蛋白去 乙酷化转移酶抑制剂通过调节巧稳态相关基因、调亡基因及突触相关基因的表达，减轻顺 销所致的小鼠听力损伤，保护内耳毛细胞。在我们已有研究中，特异性抑制组蛋白甲基化转 移酶G9a/化P能够维持线粒体稳定性，抑制Caspase-3等经典细胞调亡通路，从而实现抑制 毛细胞调亡和毛细胞保护的作用。赖氨酸特异性去甲基化酶1 (lysine-spec if i C demethylasel，LSD1)是最早发现的组蛋白去甲基化酶，它通过与CoREST形成复合物，特异 性的作用于组蛋白册K4产生去甲基作用。LSDl通过调节H3K4二甲基化水平在器官发育及细 胞存活等生命过程中发挥重要作用，抑制LSDl上调H3K4me2可W影响干细胞的定向分化和 肿瘤细胞的生长与存活（肺yte WA,Bilodeau S,Orlando DA,Hoke HA,Frampton GM, Foster CT, Cowley SM, Young RA : Enhancer decommissioning by LSDl during embiyonic stem cell differentiation.Na1:ure 2012,482(7384):221-225.)。
[0005] 因此，仍需要能够预防和治疗耳聋、降低耳毒性、减少听力损伤、保护内耳毛细胞 等方面的药物化合物。
【发明内容】
[0006] 本发明的一个目的在于提供一种如通式(I)所示的芳香环丙基胺类化合物及其药 学上可接受的盐：
[0007]
[000引 其中；
[0009]化、R2、R3和R4各自相同或不同地为氨、C1-C6烷基或面素；
[0010]优选地，Ri、R2、R3和R4各自相同或不同地为氨或面素；
[00川更优选地，Ri、R2、R3和R4各自相同或不同地为氨或氣；
[001^ 1?功直链或支链的Cl-I胞基、C3-1肺控基、C6-20芳基或苄基；
[001引优选地，R日为直链或支链的打-婚基、C3-郝控基、C6-10芳基或苄基；
[0014] 更优选地，Rs为直链或支链的Cl-6烷基、C3-7环烷基、C6-10芳基或苄基。
[0015] 术语"控基"是指烷基、締基或烘基，例如乂 1-6控基"意为具有1-6个碳原子的链控 基，例如甲基、乙基、-CH = C此、-C^CH、正丙基、异丙基、-CH = CH-C曲、-C此-CH = C此、正下 基、异下基、-CH=CH-C出-C出、-CH=CH-CH=C出、-C出-CH=CH-C出、仲下基、叔下基、正戊基、 正己基。
[0016] 所述面素指氣、氯、漠或舰，优选氣、氯或漠，更优选氣或氯。
[0017] 优选地，所述芳香环丙基胺类化合物的药学上可接受的盐为所述芳香环丙基胺类 化合物的盐酸盐：
[001 引
[0019] 其中，虹、1?2、1?3、1?4和貼如上所定义和优选。
[0020]更优选地，所述芳香环丙基胺类化合物的药学上可接受盐为：
[002'
[0022] 对于所述芳香环丙基胺类化合物的药学上可W接受的盐，包括可药用酸加成盐， 其通过用无机酸或有机酸处理该化合物的游离碱，可W得到其药学上可接受的盐。所述的 无机酸为盐酸、氨漠酸、憐酸或硫酸;所述的有机酸为抗坏血酸、烟酸、巧樣酸、酒石酸、乳 酸、马来酸、丙二酸、富马酸、乙醇酸、班巧酸，丙酸、乙酸、=氣醋酸或甲横酸等。本发明的化 合物可W W未溶剂化的和与药学上可接受的溶剂(例如水，乙醇等)溶剂化的形式存在。通 常，对于本发明的目的，认为溶剂化的形式等同于未溶剂化的形式。
[0023] 本发明的另一目的在于提供一种上述芳香环丙基胺类化合物或其药学上可接受 的盐的制备方法，该方法按如下反应路线进行，包括W下具体步骤：
[0024]
[002引其中，虹、1?2、1?3、1?4和化的定义如前所述，
[0026] 步骤a):在20~25°C的溫度下、在碱性条件下、在溶剂中将式I-I所示的取代的对 径基苯甲醒和Rs化反应16-18h得到式I -2化合物；
[0027] 其中，步骤a)中的所述碱性条件可W选择碳酸钟、碳酸钢、叔下醇钟、氨化钢等，步 骤a)中的溶剂可W选择DMF、DMSO、乙腊、二氧六环、THF等；
[0028] 其中，步骤a)中的所述溫度优选为20°C，步骤a)中的所述溶剂优选为DMF，步骤a) 中的反应时间优选为18小时；
[0029] 步骤b):在-15~-10°C的溫度下、在碱性条件下、在溶剂中将式1-2所示的化合物 和Witting试剂反应30-60分钟得到式1-3化合物；
[0030] 其中，步骤b)中的所述碱性条件可W选择乙醇钢、叔下醇钟、氨化钢、正下基裡等， 步骤b)中的溶剂可W选择乙醇、DMF、DMSO、乙腊、THF等；
[0031] 步骤b)中的所述溫度优选为-15°C，步骤b)中的所述溶剂优选为THF，步骤b)中的
所述Wi tt ing试剂优选为憐酸醋Wi tt ing试齐 步骤b)中的反应时间优选为30 分钟；
[0032] 步骤C):在30~40°C的溫度下、在碱性条件下、在溶剂中将式1-3所示的化合物和 亚甲基转移试剂反应30-60分钟得到式1-4化合物；
[0033] 其中，步骤C)中的所述碱性条件可W选择叔下醇钟、氨化钢、正下基裡等，步骤C) 中的溶剂可W选择DMF、DMSO、THF等；
[0034] 步骤C)中的所述溫度优选为30°C，步骤C)中的所述溶剂优选为DMS0,步骤C)中的 所述亚甲基转移试剂优选为=甲基硫化巧步骤C)中的反应时间优选为30分 钟；
[0035] 步骤d):在40-45°C的溫度下、在碱性条件下、在溶剂中将式1-4所示的化合物反应 3-4小时得到式1-5化合物；
[0036] 其中，步骤d)中的所述碱性条件可W选择氨氧化裡、氨氧化钢、氨氧化钟、乙醇钢 等，步骤d)中的溶剂可W选择甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇等；
[0037] 步骤d)中的所述溫度优选为40°C，步骤d)中的所述溶剂优选为甲醇，步骤d)中的 所述碱性条件优选为氨氧化钢，步骤d)中的反应时间优选为3小时；
[0038] 步骤e):在85-90°C的溫度下、在碱性条件下、在溶剂中将式1-5所示的化合物和叠 氮化试剂反应16-1化得到式1-6化合物；
[0039] 其中，步骤e)中的所述碱性条件可W选择DIPEA、S乙胺、化晚等有机碱，步骤e)中 的溶剂可W选择甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、正下醇、叔下醇等；
[0040] 步骤e)中的所述溫度优选为85 °C，步骤e)中的所述溶剂优选为叔下醇，步骤e)中 的所述叠氮化试剂优选为DPPA，步骤e)中的反应时间优选为16h;
[0041] 步骤f):在20-25°C的溫度下、在HX下、在溶剂中将式1-6所示的化合物反应3-4h得 到式1-7化合物；
[0042] 其中，步骤f)中的所述HX可W选择盐酸、S氣醋酸等，步骤f)中的溶剂可W选择乙 酸、乙酸乙醋、二氧六环等；
[0043] 步骤f)中的所述溫度优选为20°C，步骤f)中的所述溶剂优选为二氧六环，步骤f) 中的所述反应试剂优选为盐酸，步骤f)中的反应时间优选为3h。
[0044] 本发明的另一目的在于提供上述通式(I)所示化合物及其药学上可接受的盐在制 备预防或治疗与内耳毛细胞损伤相关的疾病的药物中的用途；
[0045] 本发明的另一目的在于提供上述通式(I)所示化合物及其药学上可接受的盐在预 防或治疗与内耳毛细胞损伤相关的疾病中的用途；
[0046] 本发明的另一目的在于提供一种预防或治疗与内耳毛细胞损伤相关的疾病的方 法，其特征在于，向受试者施用治疗有效量的一种或多种上述通式(I)所示化合物及其药学 上可接受的盐；
[0047] 所述与内耳毛细胞损伤相关的疾病包括神经性耳聋、混合性耳聋等；
[0048] 本发明的另一目的在于提供了一种药物组合物，其含有治疗有效量的选自上述通 式（I)的化合物及其药学上可接受的盐中的一种或多种，W及含有一种或多种可药用的载 体;该药用组合物还可W进一步包含气味剂、香味剂等。
[0049] 本发明所述的药物组合物优选含有重量比为1~99%的活性成份，其优选的比例 是，通式（I)化合物或其药学上可接受的盐作为活性成分占总重量比65%~99%。
[0050] 本发明所述的化合物和药物组合物可W是多种形式，如片剂、胶囊、粉剂、糖浆、溶 液状、悬浮液和气雾剂等，并可W存在于适宜的固体或液体的载体或稀释液中和适宜的用 于注射或滴注的消毒器具中。
【附图说明】
[0051 ]图1是斑马鱼侧线系统模型的示意图；
[0化2] 图2是正常组、对照组、Al至A8化合物处理组的神经丘免疫巧光情况；
[0化3] 图3是正常组、对照组、Al至A8化合物处理组的肌球蛋白7a+细胞数的柱状图；
[0054] 图4是反应庆大霉素损伤致小鼠耳蜗组蛋白H3K4二甲基化表达下调的图。
【具体实施方式】
[0055] 通过下列实施例说明本发明的技术方案。然而，应了解本发明保护的范围不限于 运些实施例中的特定细节，因为鉴于本发明的公开内容，其他变化对本领域普通技术人员 是已知和显而易见的。
[0056] 本发明的具有通式（I)的化合物可通过下列合成途径合成，该途径包括类似于化 学领域中所熟知的方法，特别是根据本文说明部分的方法。起始物质一般可由商业来源，如 Aldrich化学公司（美国威斯康辛州密尔瓦基)取得，或通过本领域技术人员所熟知的方法 即可制备（如通过下列书籍中所概述的方法制备：Louis F.Fieser与Mary Fieser之"用于 有机合成作用之试剂"第1-19册（美国纽约Wil巧公司1967-1999版本）；或"Beilsteins Han化Uch der organischen畑emie"Auf 1.版第4册及包括附刊（德国柏林Springer- Verlag公司出版)及亦可经由Beilstein线上资料库取得）。
[0057] 除非另有说明，在下述反应路线中，所述的化合物的各符号具有相同的含义。为了 说明的目的，下列所示的反应路线提供用于合成本发明的化合物W及关键中间产物的可能 途径。有关个别反应步骤的更详细的说明，请见后述的实施例部分。本领域技术人员将了解 可使用其他合成途径合成本发明的化合物。虽然在反应路线中显示及于后述部分论及特定 的起始物质与试剂，但其可轻易地W其他起始物质与试剂替代，从而提供多种衍生物和/或 适用其他反应条件。此外，鉴于本公开内容，可使用本领域技术人员所熟知的常规化学反 应，而进一步修饰通过本文的方法所制备的众多化合物。
[0058] 提供W下实验例W进一步阐明本发明。
[0059] 实验样品分析所用仪器及试剂
[0060] 核磁共振谱由Vari an公司的Mercury-AOO型核磁共振仪测定。LC-MS由!"Iiermo Finnigan LCQDECAXP型质谱仪测定。柱层析分离所用硅胶为青岛海洋化工厂产品（200~ 300目）。化C硅胶板为烟台化工生产的HSF-254薄层层析预制板，采用紫外灯，舰缸显色。紫 外灯为上海顾村电光仪器厂ZF-I型S用紫外分析仪。合成中所用原料为市售产品；或者通 过本领域已知的方法制备;或者根据本文所述方法制备。
[0061] 实施例1:2-(4-节氧基-3-氣苯基)环丙基胺盐酸盐(Al)的制备
[0062]
[0063] 步骤1:中间体A1-2的制备
[0064] 取250mlS 口瓶，控溫0~5°C，依次加入DMF，Al-I和K2CO3，再缓慢滴加化化，滴加完 毕，维持溫度20~25°C揽拌反应16-1化，TLC检测原料Al-I基本反应完全(PE/EA= 10:1 ,Rf =0.4)。将反应液倾倒入冰水中，揽拌5~IOmin。抽滤，滤饼用冰水淋洗，20~25 °C真空干 燥，得白色固体物16.3g，摩尔收率99%。所得粗品无需纯化，直接投入下一步反应。
[00化]步骤2:中间体A1-3的制备
[0066] 取250mlS 口瓶，控溫-5~0°C，依次加入干燥THF，t-BuOK;降溫至-15~-10°C滴加 TEPA，滴加完毕，维持溫度-15~-10°C揽拌反应30min;再滴加 A1-2/THF溶液，滴加完毕，维 持溫度-15~-10°C揽拌反应30min JLC检测原料A1-2基本反应完全(PE/EA= 10 :1 ,Rf = 0.45)。将反应液倾倒入冰水中，用EA提取2次，合并有机相，饱和盐水洗涂，无水硫酸儀干 燥，35°(：减压浓缩溶剂，得油状物粗品。柱层析纯化。6/64=10:1)，得6.1邑白色固体物，摩 尔收率93 %。
[0067] HNMR
[006引 Al-3(400MHz ,CDCb):S(ppm) 1.312-1.347(t，J = 6.SHz，3H),4.226-4.280(9, J = 6.8Hz，2H)，5.175(s，2H)，6.266-6.306(d，J=16Hz，lH),6.961-7.450(m，8H),7.548-7.588 (d，J = 16Hz，lH)。
[0069] 步骤3:中间体Al-4的制备
[0070] 取50mlS 口瓶，控溫20~25°C，依次加入DMS0，Me3S(0)I，揽拌溶清；控溫20~25 。(：，分批加入化H，揽拌反应至反应液溶清约30min;控溫20~25°C，滴加 A1-3/DMS0溶液，滴 加完毕，维持溫度30~40°C揽拌反应约30min，检测原料A1-3基本反应完全(PE/EA= 10: 1，Rf = 0.5)。将反应液倾倒入冰水中，用EA提取2次，合并有机相，饱和盐水洗涂，无水硫酸 儀干燥，35°C减压浓缩溶剂，得油状物粗品。柱层析纯化(PE/EA=10:1)，得0.86g白色固体 物，摩尔收率40 %。
[0071] HNMR
[0072] Al-4(400MHz, CDCb): 5 (ppm) 1.202-1.239(m,lH),l. 260-1.296(t, J = 7.2Hz, 3H)，I. 547-1.582(m, IH)，1.802-1.823(m, IH)，2.4:34-2.457(m，lH), 4.137-4.191(9, J = 7.2Hz，2H)，5.112(s，2H)，6.778-6.915(m，3H)，7.317-7.433(5H)。
[0073] 步骤4:中间体Al-5的制备
[0074] 取50mlS 口瓶，控溫20~25°C，依次加入MeOH，Al-4，揽拌溶清;控溫20~25°C，滴 加化OH水溶液，滴加完毕，维持溫度40~45°C揽拌反应约化，TLC检测原料A1-4基本反应完 全。6/64 = 5:1，1?' = 0.1)。35°(：减压浓缩溶剂至干，得白色固体残余物；向残余物中加入 水，用2N HCl调PH = 3~4，用EA提取2次，饱和盐水洗涂，无水硫酸儀干燥，35 °C减压浓缩溶 剂，得白色固体粗品，所得粗品无需纯化，直接投入下一步反应。
[0075] 步骤5:中间体A1-6的制备
[0076] 取50mlS 口瓶，控溫20~25 °C，依次加入t-BuOH，A1-5，揽拌溶清；再加入DPPA， TEA。控溫85~90°C，回流反应16~1她，IlX检测原料A1-5基本反应完全(PE/EA = 5:1 ,Rf = 0.45)。45°(：减压浓缩溶剂至干，再加入EA溶解，有机相依次用5%巧樣酸水溶液洗涂，饱和 盐水洗涂，饱和化HC化溶液洗涂，饱和盐水洗涂，无水硫酸儀干燥，35 °C减压浓缩溶剂，得白 色固体粗品。柱层析纯化(PE/EA = 15~10:1)，得0.25g白色固体物，摩尔收率40.3%。
[0077] HNMR
[007引 Al-6(400MHz，CDCl3): S(ppm)1.057-1.091(m，lH)，l.245-1.270(m，lH)，1.435(s, 9H),1.962-1.981(m,lH),2.620(br,lH),4.784(br,lH),5.086(s,2H),6.845-6.887(m, 3H)，7.245-7.397(m，5H)。
[0079] 步骤6:化合物Al的制备
[0080] 取50ml = 口瓶，控溫20~25°C，依次加入Al-6，盐酸二氧六环溶液，揽拌溶清;控溫 20~25 °C，揽拌反应化。TLC检测原料A1-5基本反应完全。45 °C减压浓缩溶剂至干，得白色残 余物，再加入丙酬，控溫20~25°C，揽拌反应30min。抽滤，滤饼丙酬淋洗，20~25°C真空干燥 得产品105mg，摩尔收率56%。
[0081 ] HNMR/LCMS
[0082] H003-A1(400MHz,CDsOD):5(ppm)I.261-1.297I.392-1.402 2.330-2.356(m,IH)，2.770-2.789(m,IH)，5.I14(s，2H),6.890-7.079(m，3H),7.297-7.425 (111，5扣丄〔15[]\1+扣：98.8%，258。
[00831 出施彻19.9-M-巧氧甚-S-值黑Sn抹巧基胺盐酸盐(A2)的制备 [008
[008 ;实施例1中描述的相同的方法制备化合物 A20
[008 (m,1H),1.350-1.390(m,1H),2.306-2.331 (m,] 74-7.066(m，3H)，8.603(br，3H)丄CMS[M+ 扣：t
[008 基胺盐酸盐(A3)的制备
[008
[008 ;实施例1中描述的相同的方法制备化合物 A3 O
[009 83-1.3031.383-1.418(m,4H), 2.3^ -4.113(q J = 6.細z，2H)，6.921-7.041(m, 3H).
[009 巧基胺盐酸盐(A4)的制备
[009
[0093] 除了使用2-漠丙烷代替化化W外，按照与实施例1中描述的相同的方法制备化合 物A4。
[0094] 朋03-A4(400MHz,DMSO):S(PPm)1.121-1.155(m，1H)，1.208-1.223(d,J =細Z， 6H)，1.332-1.356(m，lH),2.280-2.285(m，lH),2.693-2.713(m，1H),4.503-4.5：M(m，2H)， 6.891-7.060(m，3H)，8.558(br，3H)丄CMS[M+扣：99.3%，210.
[OOM]实施例5:2-(4-丙氧基-3-氣苯基)环丙基胺盐酸盐(A5)的制备
[0096]
[0097] 除了使用漠丙烷代替化化W外，按照与实施例1中描述的相同的方法制备化合物 ASo
[009引 HNMR/MS
[0099] A5(400MHz，DMS0):S(wm)0.94~0.97(t，J = 6.4Hz，3H)，1.13~1.17(t，J = 6.4Hz，lH) ,1.:34~1.37(m，lH),
[0100] 1.68~1.74(m，2H)，2.28~2.32(m，lH)，2.72~2.76(m，lH)，3.94~3.97(m，2H), 6.93~7.08(m，3H)，8.51(s，3H).MS[]\Wl]:210.
[0101] 实施例6:2-(4-异下氧基-3-氣苯基)环丙基胺盐酸盐(A6)的制备
[0102]
[0103] 除了使用异下基漠代替化化W外，按照与实施例1中描述的相同的方法制备化合 物A6。
[0104] A6(400MHz，DMS0):S(卵m)0.95~0.97(d，J = 6.細z，細），1.13~1.18(m，lH)，1.35 ~1.36(m，lH)，1.98~2.02(m，lH)，2.28~2.32(m，lH)，2.73~2.75(t，J = 4.4Hz，lH)，3.77 ~3.78(d，6.4Hz，2H)，6.93~7.08(m，3H)，8.55(s，3H)，MS[]\Wl]:224。
[0105] 实施例7:2-(4-正下氧基-3-氣苯基)环丙基胺盐酸盐(A7)的制备
[010<
[0107]除了使用正下基漠代替化化W外，按照与实施例1中描述的相同的方法制备化合 物A7。
[010 引 A7(400MHz，DMS0):S(wm)0.90~0.94(m，3H)，1.07~1.18(m，lH)，1.35~1.45(m, 3H)，1.65~1.70(m，2H)，2.28~2.29(m，lH)，2.72~2.75(m，lH)，3.99~4.02(m，2H)，6.93 ~7.09(m，3H)，8.46~8.50(m，3H)eMS[M+W:224。
[0109] 实施例8:2-(4-正己氧基-3-氣苯基)环丙基胺盐酸盐(AS)的制备
[0110；
[0111] 除了使用正己基漠代替化化W外，按照与实施例1中描述的相同的方法制备化合 物A8。
[0112] A8(400MHz，CD3〇D):(wm)0.91~0.93(m，3H)，1.26~1.35(m，W)，1.44~1.48(m, 2H)，1.73~1.78(m，2H)，2.29~2.33(m，lH)，2.78~2.79(m，lH)，3.99~4.02(t，J = 6.4Hz， 2H)，6.92~7.03(m，3H)eMS[M+W:252。
[0113] 生物活性测试实施例
[0114] 1)斑马鱼侧线系统模型的建立
[0115] 如图1所示，建立了斑马鱼侧线系统模型其中显示了化n3c :mGFP转基因斑马鱼的 侧线神经系统毛细胞表达绿色巧光蛋白。
[0116] 具体而言，图1显示了5dpf化n3c:GFP转基因斑马鱼侧线器及神经丘的整体观，其 中箭头代表初级侧线系统神经丘L1-L5和尾部神经丘T1-T3,星号代表次级侧线系统神经 丘D
[0117] 2)芳香环丙基胺类化合物对斑马鱼侧线系统毛细胞损伤的保护作用
[0118] 通过上述斑马鱼侧线系统模型，发明人将毛细胞分为八组，正常组W斑马鱼饲养 水培养，对照组W暴露于含400測新霉素的斑马鱼饲养水中1小时，去除新霉素后，巧光显微 镜观察斑马鱼侧线系统毛细胞损伤情况。A1-A8组W本发明相应的化合物A1-A8+含400測新 霉素的斑马鱼饲养水中培养，W检查经本申请化合物A1-A8处理后的毛细胞存活数。
[0119] 其结果显示于图巧日图3中。在图2中，第一列为化n3c:mGFP转基因斑马鱼侧线器神 经丘自带GFP绿色巧光，其表明斑马鱼毛细胞存活状态；第二列为毛细胞标志物肌球蛋白 7a，其代表毛细胞存活率;第S列为DAPI标记的细胞核，其代表毛细胞细胞核;第四列为第 一、=列合并的图示，其代表斑马鱼毛细胞自带巧光与毛细胞特异性标志物的共标结果，验 证其存活率。
[0120] 在图2中，从第一列图像可W看出，所有经本申请化合物A1-A8处理的斑马鱼均表 现有巧光，表明所有化合物均具有抗毛细胞损伤的保护作用;此外，A1-A8组巧光强于对照 组，表明所有化合物抗毛细胞损伤的保护作用高于参考物；同样，在第二列图像中，经本申 请化合物处理组的毛细胞标志物肌球蛋白7a显著高于对照组，与正常组相当，由此可W看 出本申请的化合物能够有效抑制毛细胞死亡;在第四列图像中，经本申请化合物A1-A8处理 毛细胞存活率表明能够有效抑制毛细胞死亡，且好于对照组。
[0121] 图3是图2中的毛细胞计数的柱状图，由图3可W看出，经本申请化合物处理组的毛 细胞计数显著高于对照组，特别是其中A1、A3、A6和A8的技术均达到对照组两倍W上。
[0122] 通过上述的斑马鱼平台筛选，发明人发现，芳香环丙基胺类化合物A3，A6，A8能够 有效的抑制毛细胞死亡，达到斑马鱼侧线神经丘毛细胞保护的目的，运种差异具有统计学 意义。计数结果显示新型化合物处理后毛细胞残留数均高于对照组。
[0123] 3)组蛋白册K4me2在毛细胞损伤过程中表达下调
[0124] Wlmmol庆大霉素处理小鼠耳蜗基底膜，然后用Leica sp5激光共聚焦显微镜观测 其巧光强度。结果参见图4。图4中，第1列表示肌球蛋白7a标记的毛细胞，第2列表示二甲基 化的H3K4组蛋白，第3列表示DAPI标记的细胞核，第4列是前3列图像组合的结果。其中A-C (即第1-3行)分别表示损伤0分钟、2小时和4小时之后的二甲基化的组蛋白H3K4的免疫巧光 强度变化。从第2列的对比可W看出，由庆大霉素处理毛细胞过程中，二甲基化的H3K4组蛋 白的巧光强度明显降低。从3行可W看出，庆大霉素处理的毛细胞形态受到损伤。结果可W 得出，毛细胞损伤可能与H3K4的二甲基化下调相关;本申请化合物A1-A8作用机制可能在于 特异性的作用于LSDl，通过调节组蛋白H3K4发挥作用。
[01巧]D:对照组和实验组册K4me2表达的Western blotting结果。
[01%] E:对照组和实验组册K4me2表达的Western blotting灰度分析结果。
[0127] 用Bio-Rad蛋白质印记装置进行Western blot检测。结果显示正常组（即图中nor 组)耳蜗组蛋白册K4me2(l化化)有一定强度表达；Immol庆大霉素损伤4h后（即图中crl 4h 组)耳蜗毛细胞册K4me2表达强度明显下调。E:用image J软件进行灰度分析，绘制柱状图结 果发现，庆大霉素损伤组组蛋白H3K4me2(l化化)表达强度明显减弱，与正常组相比差异具 有明显统计学意义(P<〇.05)。
[0128] 上述例子仅作为说明的目的，本发明的范围并不受此限制。对本领域的技术人员 来说进行修改是显而易见的，本发明W所附权利要求保护的范围为准。
【主权项】
1. 一种如通式(I)所示的芳香环丙基胺类化合物及其药学上可接受的盐：其中： Ri、R2、R3和R4各自相同或不同地为氢、C1-C6烷基或卤素； Rs为直链或支链的&-1()烃基、C3-1Q环烃基、C 6-2Q芳基或苄基。2. 根据权利要求1所述的芳香环丙基胺类化合物及其药学上可接受的盐， 其中，所述Rl、R2、R3和R4各自相同或不同地为氢或卤素； 所述R5为直链或支链的&-6烃基、C3-7环烃基、C6-1Q芳基或苄基。3. 根据权利要求1所述的芳香环丙基胺类化合物及其药学上可接受的盐， 其中，所述Ri、R2、R3和R4各自相同或不同地为氢或氟； 所述R5为直链或支链的&-6烷基、C3-7环烷基、C6-1Q芳基或苄基。4. 根据权利要求1所述的芳香环丙基胺类化合物及其药学上可接受的盐，其中，所述芳 香环丙基胺类化合物的药学上可接受的盐为：5. 根据权利要求1所述的芳香环丙基胺类化合物及其药学上可接受的盐， 其中，所述芳香环丙基胺类化合物的药学上可以接受的盐，包括可药用酸加成盐，其通 过用无机酸或有机酸处理该化合物的游离碱而得到的药学上可接受的盐， 所述的无机酸为盐酸、氢溴酸、磷酸或硫酸;所述的有机酸为抗坏血酸、烟酸、柠檬酸、 酒石酸、乳酸、马来酸、丙二酸、富马酸、乙醇酸、琥珀酸、丙酸、乙酸、三氟醋酸或甲磺酸。6. -种芳香环丙基胺类化合物及其药学上可接受的盐的制备方法，该方法包括以下步 骤：其中，Ri、R2、R3、R4和Rs的定义如权利要求1中所述， 步骤a):在20~25°C的温度下、在碱性条件下、在溶剂中将式1-1所示的取代的对羟基 苯甲醛和RsBr反应16-18h得到式I -2化合物； 其中，步骤a)中的所述碱性条件为碳酸钾、碳酸钠、叔丁醇钾或氢化钠，步骤a)中的溶 剂为DMF、DMSO、乙腈、二氧六环或THF; 步骤b):在-15~-10°C的温度下、在碱性条件下、在溶剂中将式1-2所示的化合物和 Witting试剂反应30-60分钟得到式1-3化合物； 其中，步骤b)中的所述碱性条件为乙醇钠、叔丁醇钾、氢化钠或正丁基锂，步骤b)中的 溶剂为乙醇、DMF、DMSO、乙腈或THF; 步骤c):在30~40°C的温度下、在碱性条件下、在溶剂中将式1-3所示的化合物和亚甲 基转移试剂反应30-60分钟得到式1-4化合物； 其中，步骤c)中的所述碱性条件为叔丁醇钾、氢化钠或正丁基锂，步骤c)中的溶剂为 DMF、DMSO或THF; 步骤d):在40-45Γ的温度下、在碱性条件下、在溶剂中将式1-4所示的化合物反应3-4 小时得到式1-5化合物； 其中，步骤d)中的所述碱性条件为氢氧化锂、氢氧化钠、氢氧化钾或乙醇钠，步骤d)中 的溶剂为甲醇、乙醇、正丙醇或异丙醇； 步骤e):在85-90°C的温度下、在碱性条件下、在溶剂中将式1-5所示的化合物和叠氮化 试剂反应16-18h得到式1-6化合物； 其中，步骤e)中的所述碱性条件为DIPEA、三乙胺或吡啶，步骤e)中的溶剂为甲醇、乙 醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇或叔丁醇； 步骤f):在20-25°C的温度下、在HX的存在下、在溶剂中将式1-6所示的化合物反应3-4h 得到式1-7化合物； 其中，步骤f)中的所述HX为盐酸或三氟醋酸，步骤f)中的溶剂为乙醚、乙酸乙酯或二氧 六环。7.根据权利要求6所述的制备方法， 其中，步骤a)中的所述温度为20 °C，步骤a)中的所述溶剂为DMF，步骤a)中的反应时间 为18小时； 步骤b)中的所述温度为-15°C，步骤b)中的所述溶剂为THF，步骤b)中的所述Witting试剂为磷酸酯Witting试剂 步骤b)中的反应时间为30分钟； ， 步骤c)中的所述温度为30°C，步骤c)中的所述溶剂为DMSO，步骤c)中的所述亚甲基转 移试剂为三甲基硫化碘步骤c)中的反应时间为30分钟； 步骤d)中的所述温度为40°C，步骤d)中的所述溶剂为甲醇，步骤d)中的所述碱性条件 为氢氧化钠，步骤d)中的反应时间为3小时； 步骤e)中的所述温度为85°C，步骤e)中的所述溶剂为叔丁醇，步骤e)中的所述叠氮化 试剂为DPPA，步骤e)中的反应时间为16h; 步骤f)中的所述温度为20°C，步骤f)中的所述溶剂为二氧六环，步骤f)中的所述HX为 盐酸，步骤f)中的反应时间为3h。8. 根据权利要求1所述的芳香环丙基胺类化合物及其药学上可接受的盐在制备预防或 治疗与内耳毛细胞损伤相关的疾病的药物中的用途。9. 根据权利要求8所述的用途，其中，所述与内耳毛细胞损伤相关的疾病为神经性耳聋 或混合性耳聋。10. -种药物组合物，其含有治疗有效量的选自根据权利要求1所述的芳香环丙基胺类 化合物及其药学上可接受的盐中的一种或多种，以及含有一种或多种可药用的载体。
【文档编号】C07C213/08GK105924362SQ201610082466
【公开日】2016年9月7日
【申请日】2016年2月5日
【发明人】崔英杰, 孔令富, 唐方强, 冯虓, 李华伟, 黎奥, 何英姿
【申请人】上海龙翔生物医药开发有限公司, 复旦大学附属眼耳鼻喉科医院