松墨天牛中性肽内切酶2基因orf全长序列及其克隆方法
【专利摘要】本发明公开了松墨天牛中性肽内切酶2基因ORF全长序列及其克隆方法，属于生物基因工程技术领域。克隆方法如下：首先用松墨天牛的成虫进行总RNA的提取，其次采用RACE扩增技术获得该基因的3′端序列，最后与实验室构建的松墨天牛cDNA文库中的NEP2基因5′端序列进行无重复拼接获得该基因ORF全长序列。该序列全长2280bp，起始密码子ATG，终止密码子TAG，共编码759个NEP2氨基酸。本发明既补充了松墨天牛神经肽酶类的基因，同时也为人类阿兹海默症(Alzheimer’s disease，AD)的研究奠定了一定的基础，具有重要生理学及医学意义。本发明是由国家自然科学基金(31470653)和广东省自然科学基金(1414050001666)支持。
【专利说明】
松墨天牛中性肽内切酶2基因 ORF全长序列及其克隆方法
技术领域
[0001] 本发明属于生物基因工程技术领域，涉及到松墨天牛中性肽内切酶2基因0RF (Open Reading Frame，开放阅读框)全序列及其克隆方法。该基因编码中性肽内切酶2,该 酶是研究神经肽酶水平调控的重要材料，具有重要的生理学及医学意义。 技术背景
[0002] 中性肽内切酶2(Neutral Endopeptidase2，neprilysin2，NEP2)是被鉴定为是一 种可溶性的糖蛋白酶。在动物中对于神经肽酶水平的控制中起着重要的作用，存在于哺乳 动物、昆虫和真菌等多种生物内，NEP2基因具有很严谨的表达形式，并且该蛋白质的定位似 乎与肾功能和精子形成有关。可能在胚发生时期关于细胞与细胞之间信号肽的新陈代谢有 重要的作用，研究表明人类的NEP2还是研究阿兹海默症(Alzheimer's disease，AD)的重要 材料，所以对NEP2的研究具有重要的生理学及医学意义。
[0003] 松墨天牛（Monochamus a 11ernatus )又名松天牛、松褐天牛，属于銷翅目 (Goleoptera)，天牛科(Cerambycidae)。它是林业非常重要的駐干害虫，主要对针叶树的木 质部与韧皮部进行危害，严重影响了松树的正常生长，同时其成虫是松材线虫病 (Pinewoodnematode)传播的主要媒介。有关松墨天牛NEP2基因目前无人研究，本发明填补 了这一空白，对深入研究松墨天牛神经肽酶水平调控及预防松材线虫病的传播奠定了基 础、甚至可以为人类一些重大疾病的预防和治疗提供新思路，具有重要生理学及医学意义。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于提供松墨天牛中性肽内切酶2基因0RF全序列及其克隆方法。 [0005]为了实现上述发明目的，本发明采取了以下技术方案：
[0006] 1、松墨天牛总RNA的提取
[0007] 将外地采集的松墨天牛活成虫经清洗、消毒、麻醉、液氮冷冻后保存在无菌去酶的 EP管中，并置于-70°C低温冰箱内保存备用。采用E.Z.N.A.? Total RNA Kit II总RNA提取 试剂盒(OMEGA)来提取松墨天牛的总RNA。
[0008] 2、引物设计和3'RACE扩增
[0009] 在本实验室构建的CDNA文库中，查找并获得了松墨天牛中性肽内切酶2基因的0RF 5'端序列，本发明是在此基础之上进行3'RACE扩增，目的在于获得松墨天牛中性肽内切酶2 基因0RF全序列。
[0010] 3'RACE扩增的特异性引物为：
[0011] MB-NEP2-37-Outer：TACGGTGCCATCGGTTT；
[0012] MB-NEP2-37-Inner：TGCCCGAACTGAAACTC〇
[0013] 3、目的基因克隆及测序
[0014]获得的PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳进行检测，回收相应目的DNA片段，同pMD20-T 载体进行连接，将连接后的产物转化到E.coli DH5a感受态细胞之中，然后进行AMP抗性蓝 白斑的筛选，挑取合适的阳性菌落进行质粒提取。最后经由菌落PCR鉴定后进行测序。
[0015] 4、序列拼接
[0016] 将测序正确的序列与实验室已构建的松墨天牛cDNA文库中的NEP2基因序列进行 不重复拼接，从而获得松墨天牛NEP2基因0RF全长序列。
[0017] 松墨天牛NEP2基因0RF全长序列，此序列如下：
[0018]
[0019]此序列中划线处标示的atg为初始密码子，划线处标示的tag为终止密码子。 [0020] 根据松墨天牛NEP2酶基因0RF全序列，得到其氨基酸序列。该序列如下：
[0024] 本发明获得了松墨天牛NEP2酶基因0RF全序列，补充了松墨天牛神经肽酶类的基 因。同时，人类的NEP2是研究阿兹海默症(Alzheimer's disease，AD)的重要材料，获得松墨 天牛NEP2基因 ORF全长序列能为新型AD疫苗的研发提供研究思路和方向。通过对松墨天牛 成虫的预处理、总RNA的提取、3'RACE扩增、目的基因片段的克隆及其序列的拼接，得到了松 墨天牛NEP2基因0RF全长序列，该0RF全长序列2280bp，共编码759个氨基酸。
【具体实施方式】
[0025]以下实施例将本发明进一步说明。
[0026] 1、松墨天牛总RNA提取
[0027]松墨天牛成虫采自广州市从化马尾松林。经清洗、消毒、麻醉、液氮冷冻后保存在 无菌去酶的EP管中，并置于-70°C低温冰箱内保存备用。
[0028] 采用E.Z.N.A.? Total RNA Kit II总RNA提取试剂盒进行松墨天牛总RNA的提取， 具体步骤如下：
[0029] 1)将松墨天牛成虫进行研磨粉碎处理后，称取O.lg样品在研钵(液氮预冷）中研磨 成粉末状，然后轻轻放入1.5mLRNaSe-free离心管中。待液氮蒸发完后迅速加入lmL RNA-Solv Reagent至离心管中，室温静置4min。
[0030] 2)往离心管里加入200yL氯仿，上下剧烈颠倒震荡20s后置于冰上孵化lOmin。
[0031] 3)在4°C条件下，12000r/min离心15min，出现上层澄清水相。
[0032] 4)上层澄清水相的80%转移到新的收集管中，加入1/3的无水乙醇，涡旋15s。
[0033] 5)将上述全部混合液转移至2mL collecting tube(带吸附柱）中，在室温下 10000r/min离心lmin，然后弃废液。
[0034] 6)重复前述步骤:室温条件下10000r/min离心lmin，然后弃废液。
[0035] 7)将吸附柱再次放入新的2mL collection tube中，往里加入300yL RNA wash Buff er 1，在室温条件下10000r/min离心lmin，然后弃废液。
[0036] 8)继续往吸附柱里加入400yL RNA wash Bufferl，在室温条件下10000r/min离心 lmin，然后弃废液。
[0037] 9)继续往吸附柱里加入500yL RNA wash Buffer2,在室温条件下10000r/min离心 lmin，然后弃废液。
[0038] 10)重复前述步骤：往吸附柱里加入500yL RNA wash Buffer2,在室温条件下 1 OOOOr/min离心lmin，然后弃废液。再次室温条件下13000r/min，离心2min。
[0039] 洗脱RNA，将吸附柱转移到新的1.5yLRNase-free离心管中，往里加40yL DEPC。在 室温条件下13000r/min，离心2min，所得溶液即所需提取的总RNA。
[0040] 注意事项:上述RNA实验所涉及的试剂，须进行干热灭菌（180°C，60min)处理，涉及 到的一次性塑料容器、无菌水须进行高温高压灭菌处理。有关RNA实验使用所涉及到的试 剂盒及无菌水都应该专用，须避免混用之后所引起的交叉污染。
[0041 ] 2、cDNA 3'末端扩增
[0042] 参照3'Full RACE Core Set Ver.2.0 kit试剂盒进行，具体操作步骤如下：
[0043] 1)反转录反应
[0044] 反应体系如下：
[0045] PCR反应程序条件:42 °C下反应60min，70 °C下反应15min。
[0046] 2)巢式PCR扩增
[0047] a)0uter PCR扩增 反应体系如下：
[0048] PCR反应程序条件:94°C下预变性4min，94°C下变性3〇8,55°(：下退火3〇8,72°(：下延 伸lmin，设置20个循环，然后72°C下延伸lOmin。
[0049] b)Inner PCR扩增 反应体系如下：
[0050] PCR反应程序条件:94°C下预变性4min，94°C下变性30s，55°C下退火30s，72 °C下延 伸lmin，设置30个循环，然后72 °C延伸lOmin。获得的PCR产物用2.0 %琼脂糖凝胶电泳实验 检测其扩增的效果。
[0051] 3、目的基因克隆及测序
[0052] 1)从琼脂糖凝胶中回收DNA片段
[0053] a)柱平衡：先将吸附柱轻轻放进收集管中，往吸附柱CB2上方中缓慢加入500yL的 平衡液BL，在室温条件下，12000r/min离心lmin，然后弃掉收集管里的废液，将吸附柱再次 缓慢放回到收集管中。
[0054] b)将琼脂糖凝胶上的目的DNA单一条带切下（尽可能地切掉多余的部分），放入到 事先已称好重量的干净离心管中，并再次称取其重量。
[0055] c)向上述放有胶块的离心管中加入与胶块等倍体积的溶液PC(如果胶块重量为 1 OOmg，其等倍体积可看作是1 OOyL，那么需要加入PC溶液的体积是1 OOyL)，55°C金属浴放置 15min左右，在这期间须不间断地上下缓慢翻转离心管，直到离心管里的胶块完全溶解。 [0056] d)将上述所得溶液缓慢加入到吸附柱CB2中（吸附柱预先放进收集管中），在室温 条件下，12000r/min离心lmin，然后弃掉收集管里的废液，将吸附柱再次缓慢放回到收集管 中。
[0057] e)往吸附柱CB2里加入漂洗液PW(已加无水乙醇)600yL，静置5min后进行离心。在 室温条件下，12000r/min离心lmin，然后弃掉收集管里的废液，将吸附柱CB2再次缓慢放回 到收集管中。
[0058] f)往吸附柱CB2里再次加入漂洗液PW(已加无水乙醇）600yL，在室温条件下， 12000r/min离心lmin，然后弃掉收集管里的废液。
[0059] g)将吸附柱CB2再次放回到收集管里，在室温条件下，12000r/min离心2min，尽可 能地去掉漂洗液。然后将吸附柱放置在室温条件5分钟左右，直至彻底晾干。
[0060] h)将吸附柱CB2再一次放回到收集管里，往其吸附膜的中间处悬空滴入适量的洗 脱缓冲溶液EB，置于室温3min，12000r/min离心2min，所得溶液即为DNA溶液。
[0061 ] i)将上述DNA产物放于-20°c冰箱保存备用。
[0062] 2)T载体连接
[0063] 往PCR管中依次加入:pMD20-T载体1. OyL，前述目标DNA产物3. OyL，去离子水1.0μ L，Solution I溶液5. OyL，整个反应体系体积为10.0 yL。在4°C冰箱中放置过夜。
[0064] 3)转化感受态细胞
[0065] a)取感受态细胞于冰水浴中融化，并分管为每管50yL。
[0066] b)每管加入4.5yL的连接产物，轻弹混均。置于冰水30min。
[0067] c)离心管置于42 °C水浴里，热激90s。
[0068] d)快速将离心管转移到冰水浴中，冷却细胞5min(此过程不要摇动离心管）。
[0069] e)吸取900yL无菌LB培养基(不含抗生素)加入到离心管中，混匀。
[0070] f)在37°C条件下，150r/min摇床振荡培养45min。
[0071] g)将离心管里的内容物充分混匀，吸取100yL已转化感受态细胞加到已配制好的 平板培养基上，用弯头玻璃棒(无菌)缓慢地将细胞均匀涂抹开来，放于室温直至培养基表 面直至液体被完全吸收后，将培养基倒置，在37°C条件下，培养箱中培养12-15h。
[0072] 4)阳性重组子的鉴定及测序
[0073] a)在每个1.5mL的离心管中分别加入含氨苄的培养液600yL，每个平板都挑选出7 个白色菌落与一个蓝色菌落分别放入培养液中，37°C下，250r/min振荡培养4h。取其菌液作 为进行菌落PCR鉴定的模板。
[0074] b)菌落 PCR 反应体系如下：
[0075] 反应程序条件为：94°C下3min ; 94°C下30s ; 55 °C下30s，设置30个循环；72 °C下 lmin;72°C下10min。反应结束后吸取5yL的反应产物，并经琼脂糖凝胶电泳实验进行检测。 [0076] c)将可能含有正确阳性重组子的克隆菌液送到生工生物公司进行测序。
[0077] 4、将测序正确的序列与实验室已构建的松墨天牛cDNA文库中的NEP2基因 Y端序 列进行不重复拼接，去掉相互重叠的部分，从而获得了松墨天牛NEP2基因0RF全长序列。
【主权项】
1. 一个松墨天牛中性肤内切酶2(肥P2)基因 ORF全长序列，其特征在于此序列是由2280 个碱基对组成，其全序列为：序列中划线标示的atg与tag分别为此编码序列的初始密码子与终止密码子，所得到的 松墨天牛肥P2基因的ORF全长序列为2280bp。2.根据权利要求1所述的松墨天牛NEP2基因的ORF全序列，其编码的蛋白质为松墨天牛 肥P2，其特征在于，松墨天牛肥P2由759个氨基酸组成，其氨基酸序列为：3. 如权利要求1所述松墨天牛肥P2基因 ORF全长序列的克隆方法，其特征在于其操作步 骤如下： (1) 松墨天牛成虫总RNA的提取； (2) cDNA第一条链的合成； (3) 3/ RACE技术扩增y端序列； (4) 所得序列与建立的松墨天牛cDNA文库中肥P2基因5/端序列进行无重复拼接，获得 其0RF全序列。4. 如权利要求3所述松墨天牛肥P2基因0RF全长序列的克隆方法，其特征在于设计了一 对特异性引物： Ma-NEP2-3^-Outer：TACGGTGCCATCGGTTT Ma-NEP2-3' -Inner:TGCCCGAACTGAAACTC。
【文档编号】C12N9/64GK105936913SQ201610239392
【公开日】2016年9月14日
【申请日】2016年4月11日
【发明人】陈敬祥, 林同, 刘琪司, 蔡紫玲, 吴华俊, 程杰, 黄卫东
【申请人】华南农业大学