一种定点敲除几丁质合成酶基因的方法

一种定点敲除几丁质合成酶基因的方法
【专利摘要】本发明公开了一种快速且高效定点敲除新型几丁质合成酶基因的方法，新型几丁质合成酶基因的DNA序列和cDNA序列如SEQ ID NO：1；本方法运用冻融法质粒转农杆菌AGL?1；采用10000个禾谷镰刀菌分生孢子和OD600为0.75的农杆菌在0.45μ尼龙膜上共培养；通过构建改良的同源重组质粒，缩短了载体构建时间；该敲除方法可大大缩短基因敲除时间和提高同源重组率提高至93.3％。并通过测定敲除突变体几丁质合成酶含量，验证了第八类几丁质合成酶基因的功能为调控几丁质合成酶合成。本发明首次在禾谷镰刀菌中发现了新一类暨第八类几丁质合成酶基因，为小麦抗赤霉病提供了新的靶标基因，同时为功能基因组学的研究提供了一种快速且高效的基因敲除方法。
【专利说明】
一种定点敲除几丁质合成酶基因的方法
技术领域
[0001] 本发明属于生物工程技术领域，尤其涉及一种快速且高效定点敲除几丁质合成酶 基因的方法。
【背景技术】
[0002] 赤霉病是一种世界性流行病害。赤霉病不仅广泛影响大麦、小麦、黑麦、裸大麦(青 稞）、水稻和玉米等作物的产量及品质，还会导致受侵害作物中含有多种衍生真菌毒素及次 生代谢物质，致使受侵害作物的种子被污染，人畜食用后均会出现呕吐、腹痛、头昏等急性 中毒现象。且毒素可在食物链中长期存留，如脱氧雪腐镰刀菌烯醇和玉米赤霉烯酮等，对食 品安全和人畜健康造成严重危害。赤霉病的危害范围广，在亚洲、欧洲和南北美洲等主要麦 类作物产区，均造成严重的经济损失。近年来由于气候变暖和稻麦轮作免耕技术的推广，赤 霉病在全球范围内逐年加重。在我国，赤霉病原先主要发生在长江中下游地区和西南地区， 现在逐步向黄淮和北方地区蔓延。
[0003] 小麦赤霉病的防治主要通过选育抗病品种、喷洒药剂等方法进行。选育抗病品种 是防治赤霉病最经济有效的方法。在过去的半个世纪中，我国选育了多个抗赤霉病品种， 如:苏麦3号、望水白、宁7840等，但小麦抗性受多基因控制和有效抗病基因的缺乏影响，培 育的赤霉菌抗病性小麦被阻碍。在我国自20世纪70年代就开始大面积使用多菌灵来防治赤 霉病。但从整体来看，赤霉病抗原相对单一，致病菌变异性强，已使病菌对其产生抗性。虽然 化学防治对控制赤霉病的大发生有一定效果，但不可避免地造成成本增加和环境污染。故 在抗赤霉病小麦材料筛选和防治措施受限的情况下，转向赤霉病致病菌株的基础研究，从 根源上防治和认识其致病机理变得十分重要。
[0004] 禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)是引发世界性流行病害赤霉病的主要优势 致病菌，也是我国最早被发现的赤霉病重要致病菌。禾谷镰刀菌对温度的适应比较强，变异 性强，其自身在不同生长时期均可发生融合现象。以上三种因素均是造成抗赤霉病研究工 作一直无法取得巨大进展的重要原因之一。禾谷镰刀菌功能基因组学研究始于2002年的全 基因组测序完成，并逐渐转入基因水平，以深入探析其致病机理并为抗赤霉病研究工作提 供参考。但目前由于功能基因研究技术有待优化，寻求更加高效，快捷的研究方法来进一步 深入研究其余功能基因和代谢途径，以更好解释禾谷镰刀菌与小麦互作机制，寻求抗赤霉 病的靶标基因。
[0005] 为了寻求新的抗赤霉病靶标基因，人们开展了功能基因的研究。禾谷镰刀菌全基 因组测序的成功为研究其基因组功能提供了遗传基础。目前对禾谷镰刀菌功能基因的研究 主要集中在致病机理和毒素产生相关基因上。而广泛应用于禾谷镰刀菌功能基因研究的方 法主要有基因芯片技术和基因敲除技术。基因芯片技术应用于子囊菌真菌，起始于1998年 对酿酒酵母的研究。随着表达序列标签(EST)、差异显示技术、微列阵和生物信息学等的应 用，2006年首次证实了禾谷镰刀菌全基因组的微列阵基因芯片是有助于探索寄主植物与真 菌致病性的基因之间的相互作用，但由于这项技术目前价格昂贵而不能被广泛应用。
[0006] 基因敲除技术应用于功能基因研究起始于上世纪80年代后半期，根据DNA同源重 组原理，使特定基因失活或缺失，实现对单个基因的精确操作。自1995年禾谷镰刀菌上第一 个致病基因被克隆后，随着筛选标记(潮霉素、遗传霉素、博来霉素等）、GFP介导的亚细胞定 位、基因沉默、RNA干扰等新技术的应用。到目前为止已经有42种蛋白激酶基因和62种转录 因子基因在禾谷镰刀菌侵染小麦时发挥重要功能，从而深刻的揭示了禾谷镰刀菌的致病分 子机制。但这项技术受限于转化所需时间和转化效率，目前已知获得最高的转化单拷贝效 率为62.2 %，相对于庞大的突变体筛选工作而言，这样的同源重组效率远远不够。
[0007] 真菌细胞壁主要由几丁质、甘露糖、葡聚糖和蛋白质等成分组成。几丁质是由N-乙 酰葡萄糖胺（GlcNAc)经β-( 1 - 4)糖苷键连接而成的寡聚物，几丁质合成酶（Chi tin Synthase，CHS)位于质膜上，以胞质侧的UDP-N-乙酰葡萄糖为底物合成几丁质，是几丁质生 物合成的重要限速酶，其在维持细胞完整性、菌丝生长、侵染寄主、无性繁殖及有性生殖等 方面均发挥重要作用。由于植物和哺乳动物中不含有几丁质合成酶的基因，因此几丁质合 成酶是真菌药物的理想靶标，并且逐渐成为寻求抗病靶标基因的热点。
[0008] CHS属多基因家族蛋白，其成员均含有保守的催化结构域和多个跨膜区。按照蛋白 主域结构分类，可将几丁质合成酶分为3个家族7种类型(如图1所示）。其中家族1包括Ι、Π 、 ΙΠ 种共3个类型;家族2包括IV、V、VII种共3个类型;家族3包括包括VI种共1个类型。家族1 都有N端（CHS N-terminal，Pfam08407)，催化结构域 1 (Chitin_synth_l，Pfam01664)，而家 族2都有催化结构域2(〇1；11:;[11_87111:11_2，？€&11103142)和细胞色素匕5结构域(071:0(3111'01116匕5-111^(101]1&;[11，？€&11100173);家族3含有催化结构域2(01；[1:;[11_87111:11_2，？€&11103142)。针对( >)1 先前在水杨酸处理的基因芯片中发现下调表达的FGSG_06550基因，通过序列比对深入分 析，发现该基因不属于任何已被鉴定的几丁质合成酶基因，且对其所属类型及家族尚未明 确。

【发明内容】

[0009] 本发明的目的在于发现新型几丁质合成酶基因，其DNA序列和CDNA序列如SEQ ID NO: 1;该类新型几丁质合成酶基因属于第8类，第三家族。
[0010] 本发明的另一目的在于提供一种高效定点敲除几丁质合成酶基因的方法，所述定 点敲除几丁质合成酶基因的方法包括：
[0011] 从禾谷镰刀菌数据库获得该类新型几丁质合成酶基因序列，通过PCR扩增获得目 的基因上游(464bp)和下游(493bp)片段，运用把11(1111、5? 61、5&(31^?&1快速限制性内切酶 对片段以及载体PRF-HU2进行双酶切;酶切产物与目标载体连接，转化大肠杆菌筛选阳性克 隆，并将构建成功质粒运用冻融法质粒转农杆菌AGL-1;采用OD600为0.75的农杆菌和10000 个禾谷镰刀菌分生孢子的在在浓度为lOmmol乙酰丁香酮和lmol EMS诱导下，并在0.45μ尼 龙膜上共培养;运用潮霉素标记筛选和分离纯化突变体，并运用分子鉴定对敲除突变体进 行确认。
[0012] 进一步，所述禾谷镰刀菌基因信息的获取从禾谷镰刀菌数据库http:// mips .helmholtz-muenchen · de/genre/pro j/FGDB/，运用MEGA软件进行对比已鉴定几丁质 合成酶基因蛋白序列，并构建系统进化树（如图3所示），运用引物设计软件： Primer5 · Ohttp: //www. premierbiosoft · com/primerdesign/index .html分另lj设计目的基 因上游和下游片段。
[0013] 进一步，所述的快速构建同源重组载体具体包括：
[0014] 根据目的片段需要，对禾谷镰刀菌基因组DNA进行PCR扩增，运用与Hindm、SpeI、 SacI、ApaI快速限制性内切酶对材料以及载体Prf-HU2进行双酶切，酶切体系（50μ1)为:样 品lOOng/yL、限制性内切酶各2000y;Cutsmart Buffer 5yL，37°C酶切20min;用DNA纯化回 收试剂盒回收酶切产物；然后用T4连接酶连接，25μ1连接体系为：片段250ng，载体13ng; T4buffer 2.5yL，T4连接酶lyL; 22 °C 连接2小时。
[0015] 进一步，所述禾谷镰刀菌分生孢子与农杆菌共培养的方法：
[0016] 10000个农杆菌新鲜的禾谷镰刀菌分生孢子悬浮液与OD600为0.75的农杆菌混合， 并加入lOmmol乙酰丁香酮摇匀，喷洒到0.45μ的尼龙膜上，置于含lmol EMS的頂固体培养基 上(如图2所示），25°C避光培养2d;
[0017] 进一步，所述禾谷镰刀菌分生孢子与农杆菌共培养的方法具体包括：
[0018] 取出禾谷镰刀菌与农杆菌共培养2d后的尼龙膜，将其剪成小块，反面置于含 100mg/L潮霉素 Β、100μΜ的链霉素和200μΜ的氨噻肟头孢霉素的SNA培养基中，25°C避光培养 5-7d;挑出能在培养基上生长的菌落，转入含100mg/L潮霉素 B的SNA培养基中；
[0019] 5-7d后选取能在培养基中稳定生长的菌落，转入普通SNA培养基中活化3-5d;
[0020] 将活化后的菌落转入CMC培养基中培养孢子;加水稀释至浓度梯度为10-3、10'10 一5倍，取100yL涂在普通SNA培养基中，25°C培养3d;挑取长出的单菌落，转移到含100mg/L潮 霉素 B的SNA培养基中，25°C避光继续培养5d，观察这些单菌落是否能够生长;将能稳定生长 的单菌落转到普通SNA培养基中，25°C下继续培养3-5d，并测定突变体几丁质和几丁质合成 酶含量。
[0021] 本发明的另一目的在于提供一种所述定点敲除几丁质合成酶基因的方法在小麦 抗赤霉病中的应用。
[0022] 本发明的另一目的在于提供一种所述定点敲除几丁质合成酶基因的方法在抗赤 霉病育种中的应用。
[0023] 本发明提供的定点敲除几丁质合成酶基因的方法，首次选择了尚未发现的第八类 几丁质合成酶基因；从单个功能基因，来研究禾谷镰刀菌与小麦互作机制，与几丁质合成酶 基因研究现状和现有通过同源重组定点敲除基因技术相比，具有以下优势：
[0024] 1.发现新型几丁质合成酶基因，补全了调控几丁质合成酶合成的相关基因；更加 全面阐述几丁质合成酶功能基因在禾谷镰刀菌中的功能。
[0025] 2.提供了 一种快速且尚效的定点敲除功能基因的方法，为禾谷镜刀菌功能基因组 学研究提供了技术参考。
[0026] 3.解释该基因在禾谷镰刀菌与小麦互作过程中的作用机制，进一步明确了禾谷镰 刀菌侵染小麦的主效功能基因，为小麦抗赤霉病提供了新的靶标基因。
【附图说明】
[0027] 图1是本发明实施案例提供的定点敲除几丁质合成酶基因的方法流程图；
[0028] 图2是禾谷镰刀菌分生孢子与农杆菌共培养方法模式图；
[0029]图3是已发现和本发明中发现的新型几丁质合成酶基因蛋白序列聚类分析示意 图；
[0030] 图4是已发现和本发明中发现的新型几丁质合成酶基因蛋白结构示意图；
[0031] 图5是本案例中新型几丁质合成酶基因缺失突变体、野生型和恢复突变体三者几 丁质合成酶含量变化柱状图。
【具体实施方式】
[0032]为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施案例，对本发 明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于 限定本发明。
[0033]本发明根据反向遗传学的策略，通过基因敲除技术，获得该基因的确实突变;探究 该基因对禾谷镰刀菌的菌丝生长、产孢子率、有性杂交、芽管萌发、毒素合成、细胞壁的完整 性进行观察;并以恢复突变体和过表达突变体作为验证，完成对该基因的功能验证;进一步 通过SA鉴定，观察该基因在禾谷镰刀菌代谢SA机制中的作用;从而接种扬花期麦穗，探知突 变菌株是否能激活小麦自身系统获得抗性，增强小麦对禾谷镰刀菌的免疫力，达到防治赤 霉病的目的，为防治小麦赤霉病提供理论参考。
[0034]本发明实施例的定点敲除几丁质合成酶基因的DNA序列和cDNA序列，如SEQ ID Ν0:1〇
[0035] 图2是本发明实施例提供的八类几丁质合成酶基因的蛋白序列结构和聚类分析示 意图。
[0036] 下面结合附图对本发明的应用原理作详细的描述。
[0037] S101:从禾谷镰刀菌数据库中下载该序列，运用MEGA软件对比已鉴定几丁质合成 酶基因蛋白序列，并进行系统进化树构建，发现该基因为新一类暨第8类几丁质合成酶基 因。
[0038] S102:根据目的基因序列，改进酶切和连接方法:在目的基因上游和下游设计同源 重组位点，并通过限制性内切酶切对同源重组位点和同源重组载体进行双酶切；回收目的 片段和载体，并运用T4连接酶连接，设计引物检测阳性克隆;改进方法大大缩短了载体构建 时间
[0039] S103:依据同源重组质粒，运用冻融法质粒转农杆菌AGL-1;采用改进的同源重组 机制暨：10000禾谷镰刀菌分生孢子和0D6QQ为0.75的农杆菌在浓度为lOmmol乙酰丁香酮和 lmol EMS诱导下，并在0.45μ尼龙膜上共培养，实现基因的同源重组，达到定点敲除新型几 丁质合成酶基因
[0040] S104:根据潮霉素标记和PCR鉴定筛选和纯化，分离纯化得到敲除突变体，计算同 源重组率为93.3%，缩短了基因敲除时间和提高了同源重组率
[0041] S105:以野生型禾谷镰刀菌中几丁质合成酶含量为对照，测定突变体中几丁质合 成酶含量，验证该类新型基因功能为参与几丁质合成酶合成
[0042] 下面结合具体实施例对本发明的应用原理作进一步的描述。
[0043]实验材料及方法：
[0044] 1实验材料
[0045] 1.1真菌菌株
[0046] 禾谷镰刀菌菌株Fgl80378,由野外感染赤霉病的小麦Roblin麦穗，剪碎接种至SNA 培养基(含100μΜ的链霉素和200μΜ的氨噻肟头孢霉素），25°C避光培养5-7d。挑出能在培养 基上生长的菌落，转入新的的SNA培养基中，培养5-6d;然后挑取禾谷镰刀菌菌丝接种于SNA 平板上，培养5-6d;挑取少量菌丝置于100mL CMC液体培养基的250mL三角瓶中，25°C， 150rpm/min培养6-7d。用无菌双层纱布过滤培养基，滤液在室温下4000rpm/min离心8分钟。 弃掉上清液，将孢子转移到无菌水中，并按照浓度梯度梯度稀释10- 3、10'10-5倍，取l〇〇yL 均匀涂在普通SNA培养基中，25°C培养3d。挑取长出的单菌落，观察这些单菌落是否为禾谷 镰刀菌，最后扩大培养，得到纯化后的禾谷镰刀菌菌株(后面统称野生型），用于后续实验。 [0047] 1.2质粒载体
[0048]大肠杆菌菌株是DH5a，根瘤农杆菌菌株是AGL-1，Prf_HU2载体用于基因敲除。
[0049] 1.3培养基配置
[0050] LB(Luria Bertani)培养基：酵母粉5g、蛋白胨10g，NaCl 10g，用双蒸水定容至 1000mL，固体培养基加 1.5 %琼脂粉，121°C高压蒸汽灭菌30min。
[0051] 頂（Induction Medium)液体培养基：KH2PO4 1.45g，K2HP〇4 2.05g，NaCl 0.15g， MgS〇4.7H20 0.5g，CaCl2.2H20 0.067g，FeS〇4.7H20 0.0025g，（NH4)2S〇4 0.5g，葡萄糖2.0g， MES(2-9(N_Morpholino)ethanesulfonic acid)8 · 54g，甘油5g，用双蒸水定容至 1000mL， 121°C高压蒸汽灭菌30min。
[0052] IM固体培养基：1000mL頂液体培养基中加入20g琼脂糖粉。
[0053] mSNA(modified Sperzieller Nahrstoffarmer Agar)培养基：KH2P〇4 lg，KN〇3 lg，MgS〇4 0.5g，KCl 0.5g，葡萄糖lg，鹿糖lg，琼脂粉20g，用双蒸水定容至1000mL，121°C高 压蒸汽灭菌30min。
[0054] CMC(Carboxymethyl cellulose)培养基：KH2P〇4 lg，NH4N〇3 lg，酵母粉lg， MgS〇4.7H2〇 0.5g，CMC 15g，用双蒸水定容至 1000mL，121°C高压蒸汽灭菌30min。
[0055] 马铃薯琼脂培养基PDA:马铃薯9.75g/L，琼脂粉9.75g/L
[0056] 1.4生化试剂
[0057] 1)常用的酶:Taq DNA Polymerase(购自于TIANGEN生化科技有限公司）、Hind III Polymerase(购自于纽英伦生物技术(北京)有限公司）、Spe I Polymerase(购自于纽英伦 生物技术(北京)有限公司）、Sac I(购自于纽英伦生物技术(北京)有限公司）、Apa I(购自 于纽英伦生物技术(北京)有限公司）、T4DNA连接酶(购自于TaKaRa生物技术有限公司）
[0058] 2)常用试剂盒:琼脂糖凝胶回收试剂盒(购自于TIANGEN生化科技有限公司）、质粒 提取试剂盒(购自于TIANGEN生化科技有限公司）
[0059] 注:其余生化试剂均为实验室常用分析纯试剂，购自美国Sigma-Aldrich公司。
[0060] 1.5重要仪器设备
[0061] 高速冷冻离心机(5417R);微量移液器(P2.5/10/20/100/200/1000);PCR 仪(ABI/ eppendorf);电泳仪（北京六一仪器厂）；分光光度计（Mapada);真空离心蒸发浓缩器 (Savant);凝胶成像分析系统;超纯水仪;灭菌锅；电子天平;恒温培养箱；电热恒温水浴锅 等。
[0062] 2.2实验方法
[0063] 2.2.1同源重组载体的构建
[0064] 2.2.1.1禾谷镰刀菌基因序列信息的获取
[0065] 从禾谷镜刀菌数据库（http://mips, he Imho ltz-muenchen .de/genre/proj/ FGDB/)，在NCBI上Blast该功能基因序列，运用MEGA软件进行对比分析。运用引物设计软件： Primer5.0分别设计目的基因上游和下游片段，保证完全敲除启动子（http:// www.premierbiosoft.com/primerdesign/index.htmL)。
[0066] 2 · 2 · 1 · 2CTAB 法提取基因组 DNA
[0067] 1)将干燥的菌丝转入到研钵中（用液氮预冷），加入液氮慢慢将其研磨成小片。
[0068] 2)用力下压并旋转将菌丝磨碎，整个过程保持菌丝处于冷冻状态。
[0069] 3)等液氮挥发完后加入液氮，并继续研磨。通常研磨三次(三次加入液氮)最后要 研磨成粉末状。
[0070] 4)等液氮挥发完全后将研磨好的粉末用无菌钥匙（用液氮预冷)转移到50mL离心 管中。
[0071] 5)加入10-20mL预热的CTAB缓冲液(55-65°C)，将粉末振荡悬浮。通常干重为lg的 菌丝加入20mL提取缓冲液。
[0072] 6)65°C静置30分钟，每隔lOmin翻转离心管混匀。
[0073] 7)加入等体积的酚:氯仿：异戊醇（25: 24:1)到离心管混匀，室温下轻摇20min后， 4000rpm/min 离心 5min 〇
[0074] 8)将上清液转入新的离心管中，加入等体积的氯仿:异戊醇(24:1)，轻摇20min后， 4000rpm/min 离心 5min 〇
[0075] 9)将上清液转移到新的离心管，加入RNaseA到终浓度5_50ug/mL，然后37°C静置 30_60min。
[0076] 10)加入等体积酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)然后轻轻翻转离心管min。
[0077] 11)4°C，4000rpm/min离心5min，将上清液转移到新的离心管中。
[0078] 12)用等体积的氯仿:异戊醇(24:1)再抽提一次，去除酚。
[0079] 13)将上清液转移到新的离心管，加入1/10体积的NaAc后再加入2倍体积的100% 乙醇(_20°C)或者0.6-1体积的异丙醇。
[0080] 14)4Γ，10000rpm/min离心10min，使DNA沉淀。
[0081 ] 15)用10mL 70%乙醇洗涤沉淀，将沉淀悬浮即可。
[0082] 16)再用10mL100%乙醇洗涤沉淀。
[0083] 17)将DNA干燥并用无菌的DDW或者TE 0.5-2mL，4°C溶解过夜并于_20°C保存。干净 的DNA块体几个小时将完全溶解，必要的话加热到70°C，5min将DNA溶解。提取过程从第7步 开始要注意动作不要太剧烈防止基因组DNA链断裂。
[0084] 2.2.1.3 PCR扩增
[0085]根据目的片段需要，对禾谷镰刀菌基因组DNA进行PCR扩增。
[0086] 25μ1 PCR反应体系为：模板DNA 100ng，nl0XTaq plus-buffer 2.5yL，Plus_dNTP Mixture 2yL(0.05mmol .L-lLF/R各0.3yL(0.1ymol .L-lLTaq plus DNA Polymeras 0.4yL( 2.5U/yL)最后加入ddH20加至反应体积至25yL。
[0087] PCR 反应程序：94°C5min，94°C45s，55.4°C45s，72°Clmin，72°C10min，12°Cm;共循 环35次。
[0088] PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳分离，切胶回收目的片段。回收方法参照TIANGEN 琼脂糖凝胶回收试剂盒的使用说明进行（注意：第一次加入EB后，室温放置2~3分钟后， 12000rpm/min离心lmin，离心后应将回收产物用枪回加回吸附柱离心，重复2~3次该操作， 以提尚回收效率）。
[0089] 2.2.1.4酶切
[0090] 用与上游酶切HindIII、SpeI和下游酶切SacI、ApaI对实验材料以及载体Prf-HU2 进行双酶切。50μ1酶切体系为：DNA 20yL(50ngAiL)，限制性内切酶各2000u(2000uAiL)， Buffer 2 5yL，37°C 酶切20min。
[0091] 2.2.1.5回收酶切产物
[0092] 回收方法参照TIANGEN DNA纯化回收收试剂盒的使用说明进行（注意在第一次加 入EB溶解后，先放置2~3min后再离心，离心后应将回收产物用枪回加如吸附柱离心，重复2 ~3次，以提高回收效率）。
[0093] 2.2.1.6酶切产物与目标载体连接，25μ1连接体系为：DNA片段5yL( 50ngAxL)， T4buffer 2.5yL，prf-HU2 0.5yL，T4连接酶lyL，22°C连接2小时。
[0094] 2.2.1.7感受态细胞的制备
[0095] 1)从-70 °C冰箱中取出保存的菌种涂抹于LB平板，37 °C过夜培养；
[0096] 2)挑选生长良好的单菌落，接种于2mL无抗生素的LB液体培养基中，37 °C 220rpm/ min振荡培养过夜；
[0097] 3)取过夜培养的活化菌液加入50mL LB液体培养基中，37°C220rpm/min振荡培养 培养至0D6QQ = 0.5(或者菌液不透明，一般为2~3h);然后冰浴20min，在4°C的离心机中 4000rpm/min离心10min去上清液;加入20mL 1.5M CaC12均勾悬浮菌体后，冰浴20_30min;
[0098] 4)4°C的离心机中4000rpm/min离心10min去上清液；加入5mL(0· 1M CaC12+15%甘 油)均匀悬浮菌体后迅速放入液氮中速冻，然后放入-70 °C保存。
[0099] 3.2.1.13转化大肠杆菌以及阳性克隆的筛选
[0100] 连接产物加入l〇〇yL大肠杆菌DH5a感受态细胞，充分混匀，冰上放置30min;42°C热 激90s，冰上放置150s后，加入液体800yL LB液体培养基，220rpm/min，37°C振荡培养lh，均 匀涂在含有kana霉素(50yg/mL)的LB平板上过夜培养。挑取过夜培养的培养平板上生长良 好的单菌落，在含有kana霉素(50yg/mL)的LB平板上过夜划单线进行扩大培养;用克隆载体 的随机引物对划线的单菌落做PCR检测(检测体系同1.8);选取阳性克隆提取质粒，质粒提 取步骤参照TIANGEN试剂盒中说明书进行，取一部分样品至公司测序，剩余贮存-20°C中保 存备用。
[0101] 2.2.1.8冻融法质粒转农杆菌
[0102] 1)取l_2yL质粒DNA加到100yL经冰上融化的农杆菌感受态中，轻摇混匀，冰浴 30min。液氮速冻5min，37 °C水浴5min，再迅速冰浴2min，加入800yL YEB液体培养基，28°C， 180rpm/min，振荡培养 4_6h。
[0103] 2)3500-4000rpm/min离心3min，去除上清液，余100_200yL菌液，混勾，均勾涂布于 含(Rif50ug/mL+Kana 50ug/mL)的YEB选择培养基上，28 °C 培养2-2 · 5d。
[0104] 3)挑取单菌落于新的含(Rif50ug/mL+Kana 50ug/mL)的YEB选择培养基，进行划线 检测，将阳性菌落接种至40yL含(Rif 50ug/mL+Kana 50ug/mL)的YEB液体培养基中培养1- 2d，至0D_ = Ο · 75，加入40 %甘油，于-70 °C保存备用。
[0105] 2.2.2基因敲除与突变体的鉴定
[0106] 2.2.2.1禾谷镰刀菌孢子的培养
[0107] 1)从超低温冰箱中取出保存具有活力的野生型菌株，接种于SNA培养基，25°C下培 养4-5d〇
[0108] 2)挑取活化后菌丝放入CMC培养基中，25°C下180rpm/min振荡培养3-4d。
[0109] 3)使用双层灭菌纱布过滤菌丝，置滤液于3000r/min下离心5min收集孢子。
[0110] 4)用20mL灭菌后的ddH2〇重悬孢子，3000r/min离心5min后弃上清。
[0111] 5)用5mL灭菌后的ddH20重悬孢子，保存于-20°C下备用(若想长期保存则加入20% 的甘油保存于_70°C的超低温冰箱）。
[0112] 6)孢子使用前需进行记数，并用灭菌后的ddH20将孢子浓度调到1 X 106个/mL。
[0113] 2.2.2.2农杆菌诱导培养
[0114] 1)将已转入Prf-HU2载体的农杆菌ALG-1在含Kan(卡纳青霉素）100mg/L的LB培养 基上划线。
[0115] 2)约24h后挑取单菌落放入含1(&11&10〇11^/1、1^以利福平)251^/1的11培养基中，28 °C，180rpm/min振荡培养2d。
[0116] 3)室温 3000rpm/min 离心 5min，收集菌体。
[0117] 4)以等体积，含200μΜ AS的頂培养基重悬菌体，28°C、180rpm/min震荡培养6h，使 农杆菌的0D600 = 0.75。
[0118] 2.2.2.3禾谷镰刀菌和农杆菌的共培养
[0119] 10000个农杆菌新鲜的禾谷镰刀菌分生孢子悬浮液与OD600为0.75的农杆菌混合， 并加入lOmmol乙酰丁香酮摇匀，喷洒到0.45μ的尼龙膜上，置于含lmol EMS的頂固体培养基 上(如图2所示），25°C避光培养2d。
[0120] 2.2.2.4敲除突变体的潮霉素筛选和分离纯化
[0121] 1)取出禾谷镰刀菌与农杆菌共培养2d后的尼龙膜，将其剪成小块(3X0. lcm)，反 向放入含l〇〇mg/L潮霉素 Β、100μΜ的链霉素和200μΜ的氨噻肟头孢霉素的SNA培养基中，25°C 避光培养5-7d。
[0122] 2)挑出能在培养基上生长的菌落，转入含100mg/L潮霉素 B的SNA培养基中。
[0123] 3)5-7d后选取能在培养基中稳定生长的菌落，转入普通SNA培养基中活化3-5d。
[0124] 4)将活化后的菌落转入CMC培养基中培养孢子，孢子的培养方法按2.1进行。
[0125] 5)获得的孢子梯度稀释10_3、10_4、10_ 5倍，取100yL均匀涂在普通SNA培养基中，25 。(:培养3d。
[0126] 6)挑取长出的单菌落，转移到含100mg/L潮霉素 B的SNA培养基中，25°C避光继续培 养5d，观察这些单菌落是否能够生长。
[0127] 7)将在含lOOmg/1潮霉素 B的SNA培养基中能稳定生长的单菌落转到普通SNA培养 基中，25°C下继续培养3-5d。将长出的菌丝放入20 %的甘油溶液中，置于-70°C的超低温冰 箱中保存。
[0128] 2.2.2.5敲除突变体的分子鉴定
[0129] 本实验采用PCR筛选法，对潮霉素基因和目的基因内部基因序列设计引物，若未扩 增到与野生型一样的条带，则说明在该突变体中，潮霉素基因很可能已经成功地替换目的 基因。反之，说明潮霉素并未正确地进行同源重组。在此基础上，再以目的基因上游序列设 计正向引物和潮霉素基因内部设计反向引物进行PCR检测，以野生型Fgl80378作为阴性对 照，扩增得到预期片段，并测序与预期序列对比验证。
[0130] 2.2.3禾谷镰刀菌突变体几丁质合成酶含量的检测
[0131 ] 通过Morgan-Elson法测量菌丝中几丁质的含量，以测定干菌丝中N-乙酰葡萄糖胺 质量的百分比来界定菌丝中几丁质的含量。分别取野生型和A FgCHS8突变体浓度为IX 105 个/mL的孢子悬液均匀涂布于含 1.5mM H2〇2，12mM HC1，1.0M NaCl，0.025%SDS，0.9mM SA和 空白对照的mSNA和PDA培养基，接种后倒置平板，28°C，避光培养4天。收集气生菌丝并用真 空离心蒸发浓缩器干燥，碾磨成细粉状，抽取3_9mg菌丝于2mL离心管中。取1毫克冻干成粉 状的菌丝，加入〇.2mL 6M HC1，100°C水解17h。在50°C恒温条件下，用真空离心蒸发浓缩器 除去HC1。待样品干燥后，加入lmL蒸馏水溶解重悬，离心后除去不溶成分。取O.lmL上清样 品，加入0. lmL溶液A[ 4 % (w/v)乙酰丙酮中含1.5M Na2C03 ]，混合均匀后，将混合液于100 °C 煮沸20min。冷却至室温后，加入0.7mL 96%乙醇，0. lmL溶液B(1.6g二甲氨基苯甲醛加入 30mL HCL和30mL 96%乙醇）。混合均匀后，室温静置lh，使其充分反应。反应充分后，使用 UV-1800的分光光度计，在波长为OD52Q下，检测吸光度，重复3次。本实验使用N-乙酰氨基葡 萄糖为标准品，绘制标准曲线。
[0132] 2.2.4数据分析
[0133] 使用（DPS软件version 12.01)t检验检测几丁质含量，几丁质合成酶活性的显著 性。
[0134] 以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精 神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种新类型暨第八类几丁质合成酶基因，其特征在于该基因有多个跨膜结构域，有 且只有一个b5结构域和C-端，所述新型几丁质合成酶基因的DNA序列，CDNA序列如SEQ ID NO:1〇2. -种高效定点敲除新型几丁质合成酶基因的方法，其特征在于通过农杆菌和禾谷镰 刀菌分生孢子在特定浓度和EMS诱导下，能提高基因同源重组效率，所述定点敲除新型几丁 质合成酶基因的方法包括： 从禾谷镰刀菌数据库获得该类新型几丁质合成酶基因序列，通过PCR扩增获得目的基 因上游464bp和下游493bp片段，运用把11(1111、3?61、3&(31^?&1快速限制性内切酶对片段以 及载体PRF-HU2进行双酶切;酶切产物与目标载体连接，转化大肠杆菌筛选阳性克隆，并将 构建成功的质粒运用冻融法转农杆菌AGL-1;采用OD600为0.75的农杆菌和10000个禾谷镰刀 菌分生孢子在浓度为lOmmol乙酰丁香酮和lmol EMS诱导下，并在0.45μ尼龙膜上共培养;运 用潮霉素标记筛选和分离纯化突变体，并运用分子鉴定对敲除突变体进行确认。3. 如权利要求2所述的定点敲除几丁质合成酶基因的方法，其特征在于，所述的快速构 建同源重组载体具体包括： 根据目的片段需要，对禾谷镰刀菌基因组DNA进行PCR扩增，运用与Hindm、SpeI、SacI、 Apal快速限制性内切酶对材料以及载体Prf-HU2进行双酶切，50μ1酶切体系为:样品100ng/ yL、限制性内切酶各2000U;Cutsmart Buffer 5yL，37°C酶切20min;用DNA纯化回收试剂盒 回收酶切产物；然后用T4连接酶连接，25μ1连接体系为：片段250ng，载体13ng; T4buffer 2 · 5yL，T4连接酶lyL; 22 °C连接2小时。4. 如权利要求2所述的定点敲除几丁质合成酶基因的方法，其特征在于，禾谷镰刀菌分 生孢子与农杆菌共培养的方法： 10000个农杆菌新鲜的禾谷镰刀菌分生孢子悬浮液与0D6QQ为0.75的农杆菌混合摇匀， 并加入lOmmol乙酰丁香酮，然后喷洒到0.45μ的尼龙膜上，置于含lmol EMS的IM固体培养基 上(如图2所示），25°C避光培养2d。5. 如权利要求2所述的定点敲除几丁质合成酶基因的方法，其特征在于，单突变体的筛 选方法： 取出禾谷镰刀菌与农杆菌共培养2d后的尼龙膜，将其剪成小块，反向放入含100mg/L潮 霉素 Β、100μΜ的链霉素和200μΜ的氨噻肟头孢霉素的SNA培养基中，25°C避光培养5-7d;挑出 能在培养基上生长的菌落，转入含l〇〇mg/L潮霉素 B的SNA培养基中； 5-7d后选取能在培养基中稳定生长的菌落，转入普通SNA培养基中活化3-5d; 将活化后的菌落转入CMC培养基中培养孢子;加无菌水稀释至浓度梯度为10-3、10-4、10 4倍，取100yL均匀涂抹于普通SNA培养基中，25°C培养3d;挑取长出的单菌落，转移到含 100mg/L潮霉素 B的SNA培养基中，25 °C避光继续培养5d，观察这些单菌落是否能够生长;将 能稳定生长的单菌落转到普通SNA培养基中，25°C下继续培养3-5d，并测定突变体几丁质 和几丁质合成酶含量。6. -种如权利要求1-8任意一项所述定点敲除几丁质合成酶基因的方法在小麦抗赤霉 病中的应用。7. -种如权利要求1-8任意一项所述定点敲除几丁质合成酶基因的方法在小麦抗赤霉 病育种中的应用。
【文档编号】C12N15/82GK105936911SQ201610130671
【公开日】2016年9月14日
【申请日】2016年3月8日
【发明人】祁鹏飞, 张亚洲, 江千涛, 魏育明, 郑有良
【申请人】四川农业大学