一种高纯度经血来源干细胞的制备方法
【专利摘要】本发明提供一种高纯度经血来源干细胞的制备方法：使用经血采集套装收集经血；收集中间层单个核细胞；加入磁珠缓冲液，充分混匀后加入FcR试剂，孵育后再加入交联抗人抗体的微磁珠试剂，混匀后孵育；再加入磁珠缓冲液，洗涤、离心后重悬于磁珠缓冲液中；加入到预先放置于磁性分选架的分选柱中，使用磁珠缓冲液冲柱洗涤；将分选柱取出，加入1.5?2ml磁珠缓冲液，收集细胞悬液；将所得悬液用经血干细胞原代培养基培养，每2?3天半量换液一次；培养5?7天后消化收集贴壁细胞，用经血干细胞传代培养基继续扩增培养；消化所得细胞，加入冻存液进行冻存。该方法获得的经血来源干细胞纯度高，生长周期短，自我更新能力强、污染率低。
【专利说明】
-种高纯度经血来源干细胞的制备方法
技术领域
[0001] 本发明设及干细胞分离纯化技术领域，具体设及一种高纯度经血来源干细胞的制 备、体外培养扩增和冻存方法。
【背景技术】
[0002] 经血干细胞来源于女性月经期间随经血脱落的子宫内膜组织，属于成体干细胞中 的一类，并有着接近胚胎干细胞的多向分化潜能，在骨损伤、脊髓损伤、神经损伤、肝病、糖 尿病、屯、血管疾病等重大疾病上有着广阔的临床应用前景。研究发现，经血来源的干细胞较 之胚胎、骨髓、厮血等干细胞有着无可比拟的优势，如:采集方法简单安全，不具有侵入性， 完全可自行采集，对供者不会造成伤害;分离的干细胞数量是骨髓来源的30倍，可W为疾病 治疗提供丰富的干细胞来源;体外增殖能力强，一般24-36小时扩增一倍，可传代高达50次； 增殖能力是骨髓干细胞的10多倍，能在短时间内提供治疗所需的足够细胞;分化潜能性大， 除具备间充质干细胞一般特征外，还能表达〇ct-4、SSEA-4和c-Kit/CD117等胚胎干细胞表 面标志物，表明经血来源干细胞在再生医学上的巨大潜能；多次传代后，染色体核型无异常 变化，动物实验显示无致瘤性，表明经血来源干细胞在临床应用领域的安全性;经血干细胞 还具有免疫原性低，可供异体移植而无免疫排斥风险等优点。此外，经血干细胞来源广泛， 理论上绝经前的大部分健康女性都可W作为潜在的供者，且不存在伦理道德争议。
[0003] 然而，现有采集和分离培养技术条件下，由于采集得到的经血样本中细胞种类繁 多，功能各异，在原代培养阶段表现为细胞形态多样，均一性差，表明其杂细胞多、干细胞纯 度低，必须再经过3-5代的培养时间才能获得纯度较高的经血干细胞，同时该技术方法下培 养细胞还存在较大的病菌、支原体污染风险。W上局限性都会影响到获得的干细胞进一步 应用于实验研究和临床应用。
【发明内容】
[0004] 本发明所要解决的技术问题是针对W上现有技术的不足，提供一种高纯度经血来 源干细胞的制备方法，通过该方法获得的经血来源干细胞具有纯度高，生长周期短，自我更 新能力强、污染率低等特点，体外培养20代W内，干细胞未出现明显衰老及分化现象，能维 持较快的增殖速度、稳定的形态和表型特征。
[0005] 本发明所采用的技术方案为：
[0006] -种高纯度经血来源干细胞的制备方法，该方法包括W下操作步骤：
[0007] (1)使用经血采集套装，将经血收集到含抗生素保存液的经血采集管中，抗生素保 存液与经血的混合体积比为（1-1.5): 1，2-8°C下低溫保存，保存期《72小时；
[000引（2)将经血采集管离屯、，弃去上清液，收集细胞沉淀；
[0009] (3)将细胞沉淀与生理盐水按1:(1-1.5)的体积比充分混合后，缓慢加入到等体积 的淋己分离液界面上，离屯、，收集中间层单个核细胞，然后生理盐水洗涂、离屯、；
[0010] (4)将获得的单个核细胞取样计细胞数，每1 X 108细胞:加入100-20化1磁珠缓冲 液，充分混匀后加入50-100μ1化R试剂，2-8°C解育5-10分钟后再加入50-100μ1交联抗人抗 体的微磁珠试剂，混匀后在2-8°C解育10-20分钟；
[0011] (5)步骤(4)所得液体再加入1-1.5ml的磁珠缓冲液，洗涂、离屯、后重悬于磁珠缓冲 液中，细胞悬液的浓度为1 X 1〇8细胞/ml;
[0012] (6)将上述细胞悬液全部加入到预先放置于磁性分选架的分选柱中，使用磁珠缓 冲液冲柱洗涂；
[0013] (7)将分选柱取出分选架，放置于无菌收集管中，加入1.5-2ml磁珠缓冲液，收集细 胞悬液；
[0014] (8)将所得悬液取样计细胞数，用经血干细胞原代培养基稀释后按5000-7000细 胞/cm2的密度接种到细胞培养瓶中，放置于37 °C、5 % C〇2培养箱培养，每2-3天半量换液一 次；
[0015] (9)细胞培养至5-7天后，倒置显微镜下观察细胞已达到70-80%密度，消化收集贴 壁细胞，按3000-5000细胞/cm2的密度接种到细胞培养瓶，用经血干细胞传代培养基继续扩 增培养；
[0016] (10)将消化所得的细胞混合于2-8°C预冷的经血干细胞冻存液中，并加入到冻存 管中，细胞密度为0.1-1 X 1〇7细胞/ml，放入冻存盒，于-80°C冰箱放置12-24小时后转入- 196°C液氮冻存。
[0017] 所述步骤（1)中抗生素保存液W皿SS化ank's平衡盐溶液)为基液，含肝素钢420单 位、头抱氨节250yg/mL、庆大霉素120yg/mL及两性霉素 B 3yg/mL。
[001引所述步骤(2)中离屯、具体为：W(400-600)Xg离屯、10分钟。
[0019] 所述步骤（4)中抗人抗体为抗人CD73、CD105、CD166、CD90、CD29、CD44、CD117、 CD34、CD45单克隆抗体中的一种。
[0020] 所述磁珠缓冲液的具体配方为：W憐酸缓冲盐溶液为基液，含体积百分比为0.5% 的胎牛血清(FBS)或牛血清白蛋白（BSA)或人血清白蛋白化SA)，含终浓度为2mM的乙二胺四 乙酸化DTA)。
[0021 ] 所述步骤(6)中分选柱为MS分选柱、LS分选柱、XS分选柱中的一种。
[0022] 所述步骤(8)中经血干细胞原代培养基:含体积百分比为30%的α-ΜΕΜ培养基，体 积百分比为40%的化ang Amnio培养基，体积百分比为29%的叫化aCULTURE培养基，体积百 分比为1 %的青/链双抗。
[0023] 所述步骤(8)中细胞培养瓶为T25方瓶或T75方瓶;所述步骤（9)中细胞培养瓶为 T150方瓶或T75方瓶。
[0024] 所述步骤(9)中经血干细胞传代培养基:含体积百分比为30%的α-ΜΕΜ培养基，体 积百分比为35%的化ang Amnio培养基，体积百分比为35%的叫化aCULTURE培养基，浓度为 10-20ng/ml的EGF(表皮生长因子），浓度为10-2化g/ml的bFGF(碱性成纤维生长因子）。
[00巧]所述步骤(9)中消化细胞采用化ypLE Express或0.25%膜酶。
[00%]所述步骤（10)中经血干细胞冻存液:含体积百分比为32-40 %的细胞培养液上清， 体积百分比为8-10 %的二甲基亚讽(DMS0)，体积百分比为25-30 %的化ang Amnio培养基， 体积百分比为25-30%的叫traCULTURE培养基。
[0027]与现有技术相比，本发明具有W下显著优点和有益效果：
[0028] (1)本发明通过磁珠分选得到带有多向分化潜能表面抗原标记的经血干细胞前体 细胞，再经过体外无血清培养基传代培养，不仅去掉了大量杂细胞，也降低了发生污染的风 险，同时由于培养起始干细胞纯度较高，干细胞扩增速度快，培养周期显著缩短，且培养所 得细胞具有多向分化能力强、临床应用安全性高的特点，具有广阔的临床治疗应用前景；
[0029] (2)获得的经血干细胞培养基为W商业培养基为原料，按一定比例进行配制所得， 不添加异源血清，成分较为明确，无外源性细菌、病毒污染风险，适合临床治疗应用；
[0030] (3)使用的冻存液有利于细胞活性维持和复苏，有利于该经血来源干细胞的功能 研究和进一步应用。
【附图说明】
[0031] 图1所示的是本发明实施例1与对比例经血干细胞培养到P1代时倒置显微镜下观 察到的细胞形态图；其中(A)为对比例的P1代细胞、(B)为实施例1的P1代细胞。
[0032] 图2所示的是本发明实施例1与对比例经血干细胞培养到P5代时细胞扩增曲线。
[0033] 图3所示的是本发明实施例1与对比例经血干细胞培养到P5代时端粒酶活性。
【具体实施方式】
[0034] W下结合实施例对本发明作进一步具体描述，但不局限于此。
[0035] 实施例1:高纯度经血来源干细胞的制备
[0036] 本实施例高纯度经血来源干细胞的制备，具体包括W下步骤：
[0037] (1)使用经血采集套装，将经血收集到含抗生素保存液的经血采集管中，抗生素保 存液与经血的混合体积比为1:1，2-8°C下低溫保存，保存期《72小时；
[0038] 所述抗生素保存液W皿SS化ank's平衡盐溶液)为基液，含肝素钢420单位、头抱氨 节250yg/mL、庆大霉素120yg/mL及两性霉素 B 3yg/mL。
[0039] (2)将采集管Weooxg离屯、10分钟，弃去上清液，收集细胞沉淀。
[0040] (3)将细胞沉淀与生理盐水按1:1的体积比充分混合后，缓慢加入到等体积的淋己 分离液界面上，离屯、，收集中间层单个核细胞，然后生理盐水洗涂、离屯、。
[0041] (4)将获得的单个核细胞取样计细胞数，每1 X 108细胞:加入10化1磁珠缓冲液，充 分混匀后加入lOOylFcR试剂(Miltenyi Biotec，货号 130-091-332)，2-8°C解育5-10分钟后 再加入 100μΙ 交联抗人抗体(抗人〔073、〔0105、〔0166、〔090、〔029、〔044、〔0117、〔034、〔045单 克隆抗体中的一种）的微磁珠试剂(Miltenyi Biotec，货号130-091-332,粒径50nm)，混匀 后在2-8 °C解育15分钟；
[0042] (5)加入1ml的磁珠缓冲液，洗涂、离屯、后重悬于磁珠缓冲液中，细胞悬液的浓度为 lXl〇8 细胞/ml;
[0043] 本实施例磁珠缓冲液的具体配方为憐酸缓冲盐溶液(PBS)为基液，含体积百分 比为0.5%的胎牛血清(FBS)或牛血清白蛋白（BSA)或人血清白蛋白化SA)，含终浓度为2mM 的乙二胺四乙酸化DTA)。
[0044] (6)将上述细胞悬液全部加入到放置于磁性分选架的MACS分选柱中，使用磁珠缓 冲液冲柱洗涂。
[0045] (7)将分选柱取出分选架，放置于无菌收集管中，加入2ml磁珠缓冲液，收集细胞悬 液。
[0046] (8)将所得悬液取样计细胞数，用经血干细胞原代培养基稀释后按6000细胞/cm2的密度接种到T25方瓶中，放置于37°C、5 % C〇2培养箱培养，每2-3天半量换液一次。
[0047] 所述经血干细胞原代培养基:含体积百分比为30 %的α-ΜΕΜ培养基，体积百分比为 40%的化ang Amnio培养基，体积百分比为29%的叫化aOJLTURE培养基，体积百分比为1 % 的青/链双抗。
[004引（9)细胞培养至5-7天后，倒置显微镜下观察细胞已达到70-80%密度，用TrypLE Express消化并收集贴壁细胞，按5000细胞/cm2的密度接种到T75方瓶，用经血干细胞传代 培养基继续扩增培养。
[0049] 所述经血干细胞传代培养基:含体积百分比为30 %的α-ΜΕΜ培养基，体积百分比为 35%的化ang Amnio培养基，体积百分比为35%的叫traCULTURE培养基，浓度为10-2化g/ml 的EGF(表皮生长因子），浓度为10-2化g/ml的bFGF(碱性成纤维生长因子）。
[0050] (10)将消化所得的细胞混合于经血干细胞冻存液中，并加入到冻存管中，细胞密 度为1-10 X 107细胞/ml，于-80°C放置12-24小时后，转入-196°C液氮冻存。
[0051] 所述经血干细胞冻存液:含体积百分比为32%的细胞培养液上清，体积百分比为 8%的二甲基亚讽(DMS0)，体积百分比为30 %的化ang Amnio培养基，体积百分比为30%的 UltraCULTURE 培养基。
[0化2] 对比例：
[0053] (1)使用经血采集套装，将经血收集到含抗生素保存液的经血采集管中，抗生素保 存液与经血的体积比为1:1，2-8°C下低溫保存，保存期《72小时；
[0054] 所述抗生素保存液W皿SS化ank's平衡盐溶液)为基液，含肝素钢420单位、头抱氨 节250yg/mL、庆大霉素120yg/mL及两性霉素 B 3yg/mL。
[0055] (2)将采集管Weooxg离屯、10分钟，弃去上清液，收集细胞沉淀。
[0056] (3)将细胞沉淀与生理盐水按1:1的体积比充分混合后，缓慢加入到等体积的淋己 分离液界面上，离屯、，收集中间层单个核细胞，然后生理盐水洗涂、离屯、。
[0057] (4)将获得的单个核细胞取样计细胞数，按6000细胞/cm2的密度接种到T25方瓶 中，放置于37°C、5%C02培养箱培养，每2-3天半量换液一次。
[005引所述经血干细胞原代培养基:含体积百分比为30 %的α-ΜΕΜ培养基，体积百分比为 40%的化ang Amnio培养基，体积百分比为29%的叫化aOJLTURE培养基，体积百分比为1 % 的青/链双抗。
[0059] (5)细胞培养至10-15天后，倒置显微镜下观察细胞已达到70-80%密度，用化ypLE Express消化并收集贴壁细胞，按5000细胞/cm2的密度接种到T75方瓶，用经血干细胞传代 培养基继续扩增培养。
[0060] 所述经血干细胞传代培养基:含体积百分比为30 %的α-ΜΕΜ培养基，体积百分比为 35%的化ang Amnio培养基，体积百分比为35%的叫traCULTURE培养基，浓度为10-2化g/ml 的EGF(表皮生长因子），浓度为10-2化g/ml的bFGF(碱性成纤维生长因子）。
[0061] (6)将消化所得的细胞混合于经血干细胞冻存液中，并加入到冻存管中，细胞密度 为1-10 X 107细胞/ml，于-80°C放置12-24小时后，转入-196°C液氮冻存。
[0062] 所述经血干细胞冻存液:含体积百分比为32%的细胞培养液上清，体积百分比为 8%的二甲基亚讽(DMSO)，体积百分比为30 %的化ang Amnio培养基，体积百分比为30%的 UltraCULTURE 培养基。
[0063] 检测方法：
[0064] ( - )细胞形态观察：
[0065] 将待检的细胞培养瓶放置于带摄像功能的倒置显微镜下观察。经血干细胞呈梭 形，具折光性，高密生长条件下成簇排列。通常细胞形态越均一表明纯度越高。
[0066] 图1所示的是本发明实施例1与对比例经血干细胞培养到P1代时倒置显微镜下观 察到的细胞形态图；其中（A)为对比例的P1代细胞、（B)为实施例P1代细胞。从(A)可W看出 对比例的P1代细胞形态多样，呈楠圆、半月、多角及梭形，而实施例1的P1代细胞形态较为均 一，主要呈长梭形(B)。由此可见，实施例1的P1代细胞中干细胞纯度显著高于对比例，且具 有典型的间充质干细胞形态特征。
[0067] (二)细胞扩增曲线：
[0068] 当细胞长到70-80%密度后，从培养箱中取出细胞消化，取0.5-lml细胞悬液样本 用细胞计数仪计数，所得细胞密度乘W细胞悬液总体积即为细胞总量。在细胞培养P1至P5 每次传代时计细胞总量。根据细胞计数结果，W培养时间（天)为横坐标，W扩增倍数为纵坐 标，绘制细胞扩增曲线(P1代细胞的扩增倍数设为1)。
[0069] 图2所示的是本发明实施例1与对比例经血干细胞培养到P5代时细胞扩增曲线;从 图2可见，实施例1的各代次细胞传代时间均早于对比例，培养期间的扩增速度也明显更快， 达到相同扩增倍数所需的生长周期也更短。
[0070] (Ξ)端粒酶活性分析：
[0071] 细胞传代培养过程中采用TRAP(端粒酶重复序列扩增程序)分析方法检测其端粒 酶活性。取IX 1〇5待测细胞，用裂解液裂解后取化g上清，进行端粒酶重复序列PCR反应，反 应产物用DIG标记的探针杂交后，用酶标仪检测吸光度。本实验中，人胚胎干细胞化ESC)作 为阳性对照（100%)。
[0072] 图3所示的是本发明实施例1与对比例经血干细胞培养到P5代时端粒酶活性。从图 3可见，实施例1的经血干细胞在各传代时间的端粒酶活性均高于对比例，表明实施例1的干 细胞具有更强的自我更新和增殖能力。
[0073] (四）细胞表面标志物流式分析：
[0074] 取(0.5-1) X106P5代经血干细胞，抗体稀释液洗涂2遍后加入扣1PE(藻红蛋白）或 FITC(异硫氯酸巧光素）标记的抗人 CD73、CD105、CD166、CD90、CD29、CD44、CD117、CD：34、 CD45、HLA-DR抗体，4-8 °C避光解育30分钟，抗体稀释液洗涂2遍后重悬于500ul抗体保存液 中。用流式细胞仪检测细胞样本中上述抗体阳性率。
[0075] 表1所示的是本发明实施例1与对比例经血干细胞培养到P5代时细胞表面标记物 的流式分析结果。从表1可见，实施例1的P5代细胞〔073、〔0105、〔0166、〔090、〔029、〔044表达 率均高于对比例细胞，表明其维持更强的间充质样干细胞特性，及更高的干细胞纯度。此 夕h实施例1干细胞还维持较高水平的CD117表达率，表明其拥有更强的生存、增殖和多系分 化能力。
[0076] 表 1
[0077]
[0078] 本发明的上述实施例是对本发明的说明而不能用于限制本发明，与本发明的权利 要求书相当的含义和范围内的任何改变，都应认为是包括在权利要求书的范围内。
【主权项】
1. 一种高纯度经血来源干细胞的制备方法，其特征在于包括以下操作步骤： (1) 使用经血采集套装，将经血收集到含抗生素保存液的经血采集管中，抗生素保存液 与经血的混合比例为（1-1.5) :l，2-8°c下低温保存，保存期<72小时； (2) 将经血采集管离心，弃去上清液，收集细胞沉淀； (3) 将细胞沉淀与生理盐水按1:(1-1.5)的体积比充分混合后，缓慢加入到等体积的淋 巴分离液界面上，离心，收集中间层单个核细胞，然后生理盐水洗涤、离心； (4) 将获得的单个核细胞取样计细胞数，每1 X 108细胞:加入100-200μ1磁珠缓冲液，充 分混匀后加入50-100μ1 FcR试剂，2-8°C孵育5-10分钟后再加入50-100μ1交联抗人抗体的 微磁珠试剂，混匀后在2-8°C孵育10-20分钟； (5) 步骤(4)所得液体再加入1-1.5ml的磁珠缓冲液，洗涤、离心后重悬于磁珠缓冲液 中，细胞悬液的浓度为1 X 1〇8细胞/ml; (6) 将上述细胞悬液全部加入到预先放置于磁性分选架的分选柱中，使用磁珠缓冲液 冲柱洗涤； (7) 将分选柱取出分选架，放置于无菌收集管中，加入1.5-2ml磁珠缓冲液，收集细胞悬 液； (8) 将所得悬液取样计细胞数，用经血干细胞原代培养基稀释后按5000-7000细胞/cm2 的密度接种到细胞培养瓶中，放置于37°C、5 % C02培养箱培养，每2-3天半量换液一次； (9) 细胞培养至5-7天后，倒置显微镜下观察细胞已达到70-80%密度，消化收集贴壁细 胞，按3000-5000细胞/cm 2的密度接种到细胞培养瓶，用经血干细胞传代培养基继续扩增培 养； (10) 将消化所得的细胞混合于2-8°C预冷的经血干细胞冻存液中，并加入到冻存管中， 细胞密度为〇. 1-1 X 1〇7细胞/ml，放入冻存盒，于-80 °C冰箱放置12-24小时后转入-196 °C液 氮冻存。2. 根据权利要求1所述的一种高纯度经血来源干细胞的制备方法，其特征在于:所述步 骤（1)中抗生素保存液以HBSS为基液，含肝素钠420单位、头孢氨苄250yg/mL、庆大霉素120μ g/mL、两性霉素 B 3yg/mL。3. 根据权利要求1所述的一种高纯度经血来源干细胞的制备方法，其特征在于:所述步 骤（4)中抗人抗体为抗人 0)73、00105、0)166、0)90、0029、0)44、00117、0)34、0)45单克隆抗 体中的一种。4. 根据权利要求1所述的一种高纯度经血来源干细胞的制备方法，其特征在于:所述磁 珠缓冲液的具体配方为：以磷酸缓冲盐溶液为基液，含体积百分比为〇. 5 %的胎牛血清或牛 血清白蛋白或人血清白蛋白，含终浓度为2mM的乙二胺四乙酸。5. 根据权利要求1所述的一种高纯度经血来源干细胞的制备方法，其特征在于:所述步 骤(6)中分选柱为MS分选柱、LS分选柱、XS分选柱中的一种。6. 根据权利要求1所述的一种高纯度经血来源干细胞的制备方法，其特征在于:所述步 骤(8)中经血干细胞原代培养基:含体积百分比为30 %的α-ΜΕΜ培养基，体积百分比为40 % 的Chang Amnio培养基，体积百分比为29%的Ultra⑶LTURE培养基，体积百分比为1 %的青/ 链双抗。7. 根据权利要求1所述的一种高纯度经血来源干细胞的制备方法，其特征在于:所述步 骤(8)中细胞培养瓶为T25方瓶或T75方瓶;所述步骤(9)中细胞培养瓶为ΤΙ50方瓶或T75方 瓶。8. 根据权利要求1所述的一种高纯度经血来源干细胞的制备方法，其特征在于:所述步 骤(9)中经血干细胞传代培养基:含体积百分比为30 %的α-ΜΕΜ培养基，体积百分比为35 % 的Chang Amnio培养基，体积百分比为35%的UltraCULTURE培养基，浓度为10-20ng/ml的 EGF，浓度为 10-20ng/ml 的 bFGF。9. 根据权利要求1所述的一种高纯度经血来源干细胞的制备方法，其特征在于:所述步 骤(9)中消化细胞采用TrypLE Express或0 · 25%胰酶。10. 根据权利要求1所述的一种高纯度经血来源干细胞的制备方法，其特征在于:所述 步骤(10)中经血干细胞冻存液:含体积百分比为32-40 %的细胞培养液上清，体积百分比为 8-10 %的二甲基亚砜，体积百分比为25-30 %的ChangAmnio培养基，体积百分比为25-30 % 的 UltraCULTURE 培养基。
【文档编号】C12N5/074GK106011052SQ201610422697
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年6月15日
【发明人】葛剑云, 汪土根, 刘心星, 黄启明
【申请人】浙江奥比特生物科技有限公司