一种从枳实中提取高纯度新橙皮苷的方法
【专利摘要】一种从枳实中提取高纯度新橙皮苷的方法，包括以下步骤：（1）将枳实原料粉碎后浸泡于水中，加入复合植物水解酶制剂进行酶解，得酶解枳实；（2）将酶解枳实加热浸提，冷却，离心，过滤，得枳实加酶浸提液；（3）将枳实加酶浸提液水浴保温，加入絮凝剂，絮凝处理，离心，过滤，得枳实絮凝液；（4）将枳实絮凝液纳滤、浓缩，真空干燥，得新橙皮苷粗品；（5）将新橙皮苷粗品用乙醇溶液充分溶解并严密过滤，然后重复进行冷却结晶和洗涤，真空干燥，得高纯度新橙皮苷产品。按照本发明方法所得产品纯度可高达98.6%，最终收率＞90%；本发明方法工艺简单，操作性强，能耗、成本低，适合工业化生产，且乙醇残留量低，环保安全。
【专利说明】
一种从枳实中提取高纯度新橙皮苷的方法
技术领域
[0001]本发明涉及一种提取高纯度新橙皮苷的方法，具体涉及一种适用于工业生产的从枳实中提取高纯度新橙皮苷的方法。
【背景技术】
[0002]枳实，属于芸香科植物，在中国分布广泛，是中国对酸橙的传统称呼，在中国传统医药界，枳实作为传统的民间草药，主要被用来增强食欲和调理气(能量)。在意大利，枳实自16世纪以来也是传统民间药方之一，被用来治疗象疟疾等热病和作为抗菌剂使用。近期研究证实，枳实可代替麻黄以治疗肥胖，同时不会出现不良的心血管方面副作用。
[0003]现代研究发现，成熟的枳实含橙皮苷(116 8口61^(1;[11)，油皮苷(naringin)，辛弗林(synephrine)，1'|-甲基酪胺(1'|-11161:1171丨713111；[116)。果实未成熟时含柚皮苷，野漆树苷(rhoifolin)，忍冬苷(1011；^61'；[11)，新橙皮苷(11601168。61^(1;[11)，在果实成熟时新橙皮苷即消失。新橙皮苷有治愈毛细血管的脆性和血浆中蛋白质通透性过高的作用，曾被称为维持毛细血管通透性的维生素或维生素P;其氢化后为新橙皮甙二氢查尔酮，属于新型甜味剂，甜度约为蔗糖的1000倍。
[0004]CN105399787A公开了一种从柑橘皮、果中提取橙皮苷、新橙皮苷和辛弗林的方法，是将枳实小果经干燥、粉碎、渗漉提取，取渗漉液过强酸性苯乙烯型阳离子柱、水洗，进大孔吸附树脂柱、水洗、20%低碳醇洗涤、70%低碳醇洗涤，取洗液浓缩，助析、结晶、重结晶，得到新橙皮苷产品。但是，其工艺路线复杂、工序多，生产难度大，不易控制、生产成本高，不适合规模化生产。
[0005]CN104587014A公开了一种提取中药枳壳中的黄酮类有效成分的方法，是取枳壳药材粉末和弗罗里硅土，以质量比1:1?4混合，加入研钵中研磨；取固相萃取柱，固相萃取柱的底部加入筛板，将研磨后的固体混合物加入固相萃取柱中，填料填实后顶部再加入筛板，将填好的固相萃取柱置于固相萃取仪上，取洗脱剂，注入固相萃取柱内，打开固相萃取仪的抽气栗，对固相萃取柱进行洗脱，收集洗脱液，洗脱结束后，将洗脱液涡旋、离心，取上层清液即为黄酮类有效成分提取液。但是，所得到的是一种低含量的混合物，且其提取不连续，采用装填方式，工序复杂且不利于规模生产。
[0006]CN103833803A公开了一种超声波提取和树脂纯化多穗柯叶中甜味剂的方法，是用超声辅助乙醇浸泡提取，其中，超声波最佳提取条件为:乙醇浓度为70%，固液比为1:25，超声波时间为35min;AB-8树脂最佳纯化工艺条件为:吸附流速为0.5mL/min，洗脱乙醇浓度为90%，洗脱体积为1.875BV，洗脱剂流速为lmL/min。但是，在此提取及纯化条件下，新橙皮苷的纯度仅为71.8226%，且该技术中使用的乙醇量大，导致规模化生产一次性投入大、生产成本高。
【发明内容】
[0007]本发明所要解决的技术问题是，克服现有技术存在的上述缺陷，提供一种产品收率高、纯度高，工艺简单，能耗低，环保无污染，适合工业化生产的从枳实中提取高纯度新橙皮苷的方法。
[0008]本发明解决其技术问题所采用的技术方案如下:一种从枳实中提取高纯度新橙皮苷的方法，其特征在于，包括以下步骤:
(1)加酶浸泡:将枳实原料粉碎后，浸泡于水中，然后加入复合植物水解酶制剂进行酶解，得酶解枳实；
(2)加热浸提:将步骤(I)所得酶解枳实加热浸提，冷却，离心，过滤，得枳实加酶浸提液；
(3)絮凝除杂:将步骤(2)所得枳实加酶浸提液进行水浴保温，加入絮凝剂，搅拌，进行絮凝处理后，离心，过滤，得枳实絮凝液；
(4)纳滤、浓缩、干燥:将步骤(3)所得枳实絮凝液进行纳滤，浓缩，真空干燥，得新橙皮苷粗品；
(5)醇相结晶干燥:将步骤(4)所得新橙皮苷粗品，用乙醇溶液充分溶解并严密过滤，然后重复进行冷却结晶和洗涤，真空干燥，得高纯度新橙皮苷产品。
[0009]步骤(I)中，所述枳实的总苷质量含量为20?30%，新橙皮苷质量含量为9?15%。
[0010]进一步，步骤(I)中，所述枳实原料粉碎后的粒径为10?30目；所述枳实原料与水的料液质量比为1:2.5?3.5。发明人实验过程中发现，当浸泡用水量低于2.5倍时，原料浸润后几乎无料液，酶加入后酶解效果差，当浸泡用水量大于3.5倍时，酶用量相同时，酶浓度下降，酶解效果差。
[0011]进一步，步骤(I)中，所述复合植物水解酶制剂为含纤维素酶、果胶酶和蛋白酶的复合酶，其中，纤维素酶:果胶酶:蛋白酶的质量比为2?3:1?2:0.5?1.0。
[0012]进一步，步骤(I)中，所述复合植物水解酶制剂添加的质量(g)为水体积(mL)的
0.01?0.03w/v%(优选0.015?0.020w/v%)。所述复合植物水解酶制剂的加入，有利于枳实原料细胞壁的破碎，果胶蛋白等的降解，从而有利于新橙皮苷的溶出，但若添加量小于0.01w/v%，会导致酶解效果下降，而添加量高于0.03 w/v%又无明显效果提升，继续增加酶用量只会损耗酶制剂。
[0013]进一步，步骤(I)中，所述酶解的温度为40?50°C，酶解的时间为120?180min。所述酶解温度下，复合植物水解酶制剂酶解活性最佳;当酶解时间小于120min后，酶解效果不充分；当酶解时间大于ISOmin后，酶解效率趋于平稳状态，收率几乎不增加，继续延长提取时间无意义。
[0014]进一步，步骤(2)中，所述浸提为连续逆流提取，浸提的温度为80?95°C(优选88?90°C )，浸提的时间为60?120min。
[0015]进一步，步骤(2)中，浸提加入水的质量为枳实原料质量的6?8倍。若浸泡用水量低于6倍，则新橙皮苷收率会急剧下降，而用水量高于8倍以后新橙皮苷收率几乎无增加，再继续增加用水量无意义。
[0016]步骤(2)中，为了进一步降低能耗，所述冷却只需将温度降至步骤(3)絮凝除杂所需温度即可。
[0017]步骤(2)中，所述离心为三足沉降离心，离心速率为1000?1500r/min。
[0018]进一步，步骤(3)中，所述絮凝剂为氯化铁和生石灰，先用氯化铁絮凝处理后，再用生石灰絮凝处理，两次絮凝处理的温度均为40?60°C，絮凝处理的时间均为60?80min。所述絮凝剂絮凝效果好，价格低廉，添加量少，符合工业生产的需要。
[0019]进一步，步骤(3)中，所述每种絮凝剂的用量为1.5?3.0g/L。絮凝剂添加越多，原料损失越大，当添加量超过3.0g/L时，损失率出现拐点，损失率急剧上升，而絮凝效果在3.0g/L后无明显提升，当添加量低于1.5g/L时絮凝效果不能达到絮凝目的，在所述添加量下，絮凝溶液略显碱性，损失率少。发明人研究发现，当水温在40?60°C、絮凝时间为60?SOmin时，絮凝效果基本在同一水平线上，但随着絮凝时间延长，絮凝损失率有较大差异，为保证产品收率及保持絮凝效果的平衡，在所述温度和时间下絮凝损失率最低。
[0020]步骤(3)中，所述离心为先进行卧螺离心，离心速率为2500?3500r/min，再进行碟式离心，离心速率为5000?7000r/min。
[0021]进一步，步骤(4)中，所述纳滤所用纳滤膜的截留分子量为5000?8000Da，操作压力为1.0?1.5MPa，物料温度为10?25°C，纳滤至滤出液电导率<500ys/cm为止;所述浓缩为真空浓缩，真空压力为-0.09?-0.07MPa，温度为50?80 °C，浓缩至浓缩液质量为原料质量的40?50%为止。所述纳滤膜优选陶氏DOW NF90-400型纳滤膜，纳滤的作用是分离纯化、脱色、除无机盐、浓缩等。
[0022]进一步，步骤(5)中，所述乙醇溶液的体积分数为70?90%;所述乙醇溶液的用量为每10mL乙醇中溶解新橙皮苷粗品40?60g;所述溶解的温度为50?70°C。
[0023]进一步，步骤(5)中，所述冷却结晶的温度为2?5°C，重复次数彡2次；用2?5°C的冰水进行洗涤，每次洗涤水用量为I?2倍晶体体积。
[0024]本发明方法的有益效果如下:
(1)按照本发明方法所提取的高纯度新橙皮苷产品呈白色或米白色粉末状，经高效液相色谱法检测，所得新橙皮苷的纯度可高达98.6%，杂质含量少，新橙皮苷的最终收率>90%；
(2)本发明方法采用加酶浸泡、加热浸提、絮凝除杂相结合的方法大大的提高了新橙皮苷的最大浸出量，同时使得枳实中的杂质絮凝，方便后续纯化；
(3)本发明方法采用纳滤膜脱去大量的如果胶、蛋白、色素、小分子有机物、无机盐等杂质，不仅达到纯化的目的，且在纯化的同时进行了浓缩，也一定程度减少后续真空浓缩的能耗，降低生产成本，明显优于现有常规的大孔树脂吸附法纯化新橙皮苷的方法；
(4)本发明方法在结晶前的提取、纯化过程中只使用到纯水，工艺简单，成本低，可操作性强，适合工业化生产，食用乙醇在最终产品中的残留量控制在100 ppm以下，相对于现有技术所使用的对人体有害的有机溶剂更加环保安全。
【具体实施方式】
[0025]下面结合实施例对本发明作进一步详细说明。
[0026]本发明实施例所使用的枳实干果(含总苷为21.37%，新橙皮苷10.27%)为市售，产地江西;所使用的复合水解酶制剂的型号为:诺维信复合植物水解酶Viscozyme L，其中，纤维素酶:果胶酶:蛋白酶的质量比为2.5:1.5:0.8，购于吉宝(青岛)生物科技有限公司;所使用的纳滤膜为陶氏DOW NF90-400型纳滤膜，购于广州华膜水处理设备有限公司；结晶所使用的乙醇为体积分数95%的食品级原料;其它所使用的化学试剂，如无特殊说明，均通过常规商业途径获得。
[0027]实施例1
(1)加酶浸泡:将500g枳实干果粉碎至10?30目后，浸泡于1250mL水中，然后加入
0.125g复合植物水解酶制剂，在400C下，酶解120min，得酶解枳实；
(2)加热浸提:在步骤(I)所得酶解枳实中加入3kg水，在80°C下，连续逆流浸提60min，冷却至45°C，在1200r/min速率下进行三足沉降离心，过滤，得3020mL枳实加酶浸提液；
(3)絮凝除杂:将3020mL步骤⑵所得枳实加酶浸提液进行水浴保温，加入6.0g氯化铁，搅拌，在45 0C下，絮凝处理60min后，再加入6.0g生石灰，搅拌，在45 °C下，絮凝处理60min后，在3000r/min速率下进行卧螺离心，再在6000r/min速率下进行碟式离心，过滤，得2950mL枳实絮凝液；
(4)纳滤、浓缩、干燥:将2950mL步骤(3)所得枳实絮凝液用截留分子量5000Da的纳滤膜，在操作压力为1.2MPa，物料温度12 V下，纳滤至滤出液电导率为500yS/cm为止，然后将截留液在真空压力-0.08510^，温度50°(:下，真空浓缩至2008，最后真空干燥，得133.08新橙皮苷粗品；
(5)醇相结晶干燥:将步骤(4)所得133.0g新橙皮苷粗品，用250mL体积分数75%的乙醇，在55 0C下，进行充分溶解后，严密过滤，然后置于2°C下冷却结晶，得250mL晶体，再用250mL，2 °C的冰水进行洗涤，重复冷却结晶、洗涤2次，真空干燥，得47.6g新橙皮苷产品。
[0028]所得新橙皮苷产品呈白色粉末状，经高效液相色谱法检测，新橙皮苷的纯度为98.3%，最终收率为91.12%ο
[0029]实施例2
(1)加酶浸泡:将500g枳实干果粉碎至10?30目后，浸泡于1500mL水中，然后加入0.30g复合植物水解酶制剂，在45 0C下，酶解150min，得酶解枳实；
(2)加热浸提:将步骤(I)所得酶解枳实加入3.5kg水，在90°C下，连续逆流浸提90min，冷却至50°C，在1200r/min速率下进行三足沉降离心，过滤，得3480mL枳实加酶浸提液；
(3)絮凝除杂:将3480mL步骤(2)所得枳实加酶浸提液进行水浴保温，加入8.0g絮氯化铁，搅拌，在50 0C下，絮凝处理70min后，再加入8.0g生石灰，搅拌，在50 °C下，絮凝处理70min后，在3000r/min速率下进行卧螺离心，再在6000r/min速率下进行碟式离心，过滤，得3450mL枳实絮凝液；
(4)纳滤、浓缩、干燥:将3450mL步骤(3)所得枳实絮凝液用截留分子量SOOODa的纳滤膜，在操作压力为1.4MPa，物料温度16°C下，纳滤至滤出液电导率为500yS/cm为止;然后将截留液在真空压力-0.0810^，温度60°(:下，真空浓缩至2108，最后真空干燥，得134.88新橙皮苷粗品；
(5)醇相结晶干燥:将步骤(4)所得134.Sg新橙皮苷粗品，用280mL体积分数75%的乙醇，在60 0C下，进行充分溶解后，严密过滤，然后置于5°C下冷却结晶，得280mL晶体，再用300mL，5°C的冰水进行洗涤，重复冷却结晶、洗涤2次，真空干燥，得48.1g新橙皮苷产品。
[0030]所得新橙皮苷产品呈米白色粉末状，经高效液相色谱法检测，新橙皮苷的纯度为98.2%，最终收率为91.98%ο
[0031]实施例3
(I)加酶浸泡:将500g枳实干果粉碎至10?30目后，浸泡于1700mL水中，然后加入0.50g复合植物水解酶制剂，在50°C下，酶解180min，得酶解枳实；
(2)加热浸提:将步骤(I)所得酶解枳实加入4.0kg水，在95°C下，连续逆流浸提120min，冷却至55°C，在1200r/min速率下进行三足沉降离心，过滤，得4180mL枳实加酶浸提液；
(3)絮凝除杂:将4180mL步骤(2)所得枳实加酶浸提液进行水浴保温，加入12.0g氯化铁，搅拌，在55 0C下，絮凝处理SOmin后，再加入8.0g生石灰，搅拌，在55 °C下，絮凝处理SOmin后，在3000r/min速率下进行卧螺离心，再在6000r/min速率下进行碟式离心，过滤，得4135mL枳实絮凝液；
(4)纳滤、浓缩、干燥:将4135mL步骤(3)所得枳实絮凝液用截留分子量SOOODa的纳滤膜，在操作压力为1.5MPa，物料温度20 V下，纳滤至滤出液电导率为500yS/cm为止;然后将截留液在真空压力-0.07MPa，温度70°C下，真空浓缩至206g，最后真空干燥，得135.4g新橙皮苷粗品；
(5)醇相结晶干燥:将步骤(4)所得135.4g新橙皮苷粗品，用300mL体积分数75%的乙醇，在65 0C下，进行充分溶解后，严密过滤，然后置于2°C下冷却结晶，得300mL晶体，再用350mL，2 °C的冰水进行洗涤，重复冷却结晶、洗涤2次，真空干燥，得48.0g新橙皮苷产品。
[0032]所得新橙皮苷产品呈白色粉末状，经高效液相色谱法检测，新橙皮苷的纯度为98.6%，最终收率为92.17%。
【主权项】
1.一种从枳实中提取高纯度新橙皮苷的方法，其特征在于，包括以下步骤: (1)加酶浸泡:将枳实原料粉碎后，浸泡于水中，然后加入复合植物水解酶制剂进行酶解，得酶解枳实； (2)加热浸提:将步骤(I)所得酶解枳实加热浸提，冷却，离心，过滤，得枳实加酶浸提液； (3)絮凝除杂:将步骤(2)所得枳实加酶浸提液进行水浴保温，加入絮凝剂，搅拌，进行絮凝处理后，离心，过滤，得枳实絮凝液； (4)纳滤、浓缩、干燥:将步骤(3)所得枳实絮凝液进行纳滤，浓缩，真空干燥，得新橙皮苷粗品； (5)醇相结晶干燥:将步骤(4)所得新橙皮苷粗品，用乙醇溶液充分溶解并严密过滤，然后重复进行冷却结晶和洗涤，真空干燥，得高纯度新橙皮苷产品。2.根据权利要求1所述从枳实中提取高纯度新橙皮苷的方法，其特征在于:步骤(I)中，所述枳实原料粉碎后的粒径为10?30目；所述枳实原料与水的料液质量比为1:2.5?3.5。3.根据权利要求1或2所述从枳实中提取高纯度新橙皮苷的方法，其特征在于:步骤(I)中，所述复合植物水解酶制剂为含纤维素酶、果胶酶和蛋白酶的复合酶，其中，纤维素酶:果胶酶:蛋白酶的质量比为2?3:1?2:0.5?1.0。4.根据权利要求1?3之一所述从枳实中提取高纯度新橙皮苷的方法，其特征在于:步骤(I)中，所述复合植物水解酶制剂添加的质量为水体积的0.01?0.03w/v%;所述酶解的温度为40?50°C，酶解的时间为120?180min。5.根据权利要求1?4之一所述从枳实中提取高纯度新橙皮苷的方法，其特征在于:步骤(2)中，所述浸提为连续逆流提取，浸提的温度为80?95°C，浸提的时间为60?120min;浸提加入水的质量为枳实原料质量的6?8倍。6.根据权利要求1?5之一所述从枳实中提取高纯度新橙皮苷的方法，其特征在于:步骤(3)中，所述絮凝剂为氯化铁和生石灰，先用氯化铁絮凝处理后，再用生石灰絮凝处理，两次絮凝处理的温度均为40?60°C，絮凝处理的时间均为60?80min。7.根据权利要求6所述从枳实中提取高纯度新橙皮苷的方法，其特征在于:步骤(3)中，所述每种絮凝剂的用量为1.5?3.0g/L。8.根据权利要求1?7之一所述从枳实中提取高纯度新橙皮苷的方法，其特征在于:步骤(4)中，所述纳滤所用纳滤膜的截留分子量为5000?8000Da，操作压力为1.0?1.5MPa，物料温度为10?25°C，纳滤至滤出液电导率<500ys/cm为止;所述浓缩为真空浓缩，真空压力为-0.09?-0.07MPa，温度为50?80°C，浓缩至浓缩液质量为原料质量的40?50%为止。9.根据权利要求1?8之一所述从枳实中提取高纯度新橙皮苷的方法，其特征在于:步骤(5 )中，所述乙醇溶液的体积分数为70?90%;所述乙醇溶液的用量为每10mL乙醇中溶解新橙皮苷粗品40?60g;所述溶解的温度为50?70°C。10.根据权利要求1?9之一所述从枳实中提取高纯度新橙皮苷的方法，其特征在于:步骤(5)中，所述冷却结晶的温度为2?5°C，重复次数多2次；用2?5°C的冰水进行洗涤，每次洗涤水用量为I?2倍晶体体积。
【文档编号】C07H1/08GK106083940SQ201610539313
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年7月11日
【发明人】龙伟岸, 黄华学
【申请人】湖南华诚生物资源股份有限公司