专利名称：一种细菌硝基还原酶检测试剂盒及其专用荧光探针的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种细菌硝基还原酶检测试剂盒及其专用荧光探针。
背景技术：
细菌硝基还原酶(nitroreductase, NTR)属于依赖黄素单核苷酸(flavinmononucleotide, FMN)的硝基还原酶超家族，通常以二聚体形式存在。它们可利用还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(磷酸)(reduced nicotinamide adeninedinucleotide (phosphate) ,NAD (P)H)作为电子供体，催化多种外源硝基芳香族、硝基杂环、醌类和黄素类化合物的还原反应，硝基基团作为生物医药、抗菌剂和杀虫剂中常见的官能基团，其还原是实现硝芳基污染物降解的关键步骤，在药物的激活和解毒机制中也发挥重要的作用。目前用于检测细菌硝基还原酶方法报道的很少。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于检测细菌硝基还原酶的荧光探针及其制备方法。本发明所提供的检测细菌硝基还原酶的荧光探针为7_[ (5-硝基噻吩-2-基)甲氧基]-3H-吩恶嗪-3-酮，其结构式如式I所示:
权利要求
1.式1所示的化合物:
2.制备权利要求1所述式I所示的化合物的方法，包括下述步骤:在催化剂存在的条件下，将式II所示的7-羟基吩恶嗪酮钠盐与式III所示的2-溴甲基-5-硝基噻吩进行反应，得到所述式1所示化合物；
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于:所述催化剂选自有机碱和无机碱中的至少一种；所述有机碱选自三乙胺和吡啶中的至少一种；所述无机碱选自碳酸钾、氢氧化钠、碳酸钠和碳酸氢钠中的至少一种。
4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于:所述7-羟基吩恶嗪酮钠盐、2-溴甲基-5-硝基噻吩和催化剂的投料摩尔比为1: 0.5 5: 0.5 5，优选1: 1_4: 1-4,更优选1:1:1或1: 4: 4; 所述反应的反应温度为0°C 60°C，优选为室温，反应时间为I 24小时；所述反应在有机溶剂中进行，所述有机溶剂选自N，N-二甲基甲酰胺、三乙胺、四氢呋喃和乙腈中的至少一种。
5.一种细菌硝基还原酶检测试剂盒，其包括试剂储备液I和试剂储备液2 ;所述试剂储备液I为含辅酶的缓冲液，所述试剂储备液2为权利要求1中式I所示的化合物的溶液。
6.根据权利要求5 所述的试剂盒，其特征在于:所述试剂储备液I中，所述缓冲液为pH值为6 9的磷酸盐缓冲液，所述磷酸盐选自Na2HP04、NaH2PO4和KH2PO4中的至少一种；所述磷酸盐的浓度为0.01 0.5M ;所述辅酶为烟酰胺腺嘌呤二核苷酸或烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸，其浓度为0.01 0.1mM ; 所述试剂储备液2中，所述式I所示的化合物的浓度为0.5 2mM ;溶剂为乙醇或二甲基亚讽。
7.根据权利要求5或6所述的试剂盒，其特征在于:所述细菌硝基还原酶检测试剂盒由所述试剂储备液I和试剂储备液2组成。
8.权利要求5-7中任一项所述试剂盒在测定硝基还原酶含量中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于:测定硝基还原酶含量的方法，包括如下步骤: I)制作标准曲线: a)以550nm作为激发波长，测定一系列不同浓度的硝基还原酶标准品的溶液在发射波长为585nm处的荧光强度，记为F ;并测定试剂空白在发射波长为585nm处的荧光强度，记为Ftl,以硝基还原酶的浓度C为横坐标，荧光强度变化值AF为纵坐标，绘制标准曲线； 其中，AF = F-F0 ;所述一系列不同浓度的硝基还原酶标准品的溶液由权利要求5-7中任一项所述硝基还原酶检测试剂盒中的试剂储备液1、试剂储备液2和硝基还原酶的标准储备溶液混匀而得； 2)检测待测样品中硝基还原酶的含量: 将所述步骤I)所述硝基还原酶标准品替换为待测样品，按照所述步骤I)所述方法检测所述待测样品在发射波长为585nm处的荧光强度，记为F’，将所述F’代入所述步骤I)所得标准曲线，进而得到所述待测样品中硝基还原酶的含量。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于:所述一系列不同浓度的硝基还原酶标准品的溶液中，所述硝基还原酶的浓度依次为0，0.005,0.01,0.025,0.05,0.1,0.15,0.2，.0.3,0.6，0.8 和 I μ g/mL ； 所述一系列不同浓度的硝基还原酶标准品的溶液的体积均为2mL ； 所述硝基还原酶的标准储备溶液中，溶剂为水；所述硝基还原酶的标准储备溶液中硝基还原酶的浓度为500 μ g/mL ； 所述硝基还原酶检测试剂盒中 的试剂储备液I和所述试剂储备液2的体积比为2mL ； 10 μ L0
全文摘要
本发明公开了一种细菌硝基还原酶检测试剂盒及其专用荧光探针。所述荧光探针的结构式如式I所示。所述细菌硝基还原酶检测试剂盒，包括试剂储备液1和试剂储备液2；其中，试剂储备液1为含有辅酶的缓冲液，试剂储备液2为所述荧光探针的溶液。实验发现，所述探针本身的荧光强度非常弱，加入硝基还原酶后，探针发生1，6-重排消除反应，释放出resorufin荧光母体，溶液荧光显著增强并且颜色由几乎无色变成紫红色，表明该方法可用于硝基还原酶的检测。本发明具有操作简便，成本低，快速高效灵敏等优点，易于推广和应用，在食品、医药等领域中有着巨大的应用前景。(式I)
文档编号C09K11/06GK103242306SQ20131017486
公开日2013年8月14日 申请日期2013年5月13日 优先权日2013年5月13日
发明者马会民, 李照 申请人:中国科学院化学研究所