一种叶酸偶联的水溶性上转换纳米颗粒及其制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种叶酸偶联的水溶性上转换纳米颗粒及其制备方法，首先采用高温热分解法合成六方相的上转换发光纳米颗粒UCNPs，然后采用四氟硼酸亚硝鎓NOBF4处理UCNPs，取代其表面的油酸分子，再与亲水性超支化聚合物反应，得到超支化聚合物修饰的水溶性上转换纳米颗粒，最后与叶酸反应，得到叶酸偶联的水溶性上转换纳米颗粒。本发明制备的叶酸偶联的水溶性上转换纳米颗粒具有良好分散性、生物相容性及靶向性等优点，可用于癌症细胞的靶向成像。
【专利说明】 一种叶酸偶联的水溶性上转换纳米颗粒及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种叶酸偶联的水溶性上转换纳米颗粒及其制备方法，属于纳米材料领域。
【背景技术】
[0002]稀土上转换发光材料Up-convers1n(UC)是一种在近红外光激发下发出可见光的发光材料，即可通过多光子机制把长波辐射转换成短波辐射。这种材料发光违背Stokes定律，因此又被称为反Stokes定律发光材料。UC发光是基于稀土元素4f电子间的跃迁。发光过程可以分为三步:①基质晶格吸收激发能；②基质晶格将吸收的激发能传递给激发离子，使其激发被激发的稀土离子发出荧光而返回基质。上转换过程主要有激发态吸收、能量传递、直接双光子吸收和光子雪崩四种形式。
[0003]稀土发光材料主要有基质材料、激活剂(发光中心)、共激活剂和敏化剂等组成。上转换发光的效率在很大程度上取决于上转换的基质材料。基质材料本身不发光，但能为激活离子提供合适的晶体场，使其产生合适的发射。基质材料的选择一般要求具有与掺杂离子相匹配的晶格、较好的化学稳定性和较低的晶格振动声子能量等。根据基质材料组分的不同，可以将上转换发光材料的基质主要分为氧化物、卤化物和硫化物等。YF3、LaF3> NaYF4和LiYF4等材料都是非常好的基质，在近红外光激发下发射出可见光甚至是紫外光。
[0004]上转换发光纳米材料(UCNPs)具有高的化学稳定性、优异的光稳定性、窄带隙发射，在近红外激光激发下具有较强的组织穿透能力、对生物组织无损伤、无背景荧光的干扰，在生物医学等方面有着广泛的应用，如生物成像、生物检测、多模态成像、癌症光动力治疗、载药等。此外，除了在上述生物领域的应用广受关注之外，在非生物领域(如光信息存储、3D显示、安全防伪及太阳能电池等)也有着很好的应用前景。
[0005]到目前为止，合成UCNPs的方法主要有沉淀/共沉淀法，水热/溶剂热法，热裂解法，溶胶-凝胶法和自蔓延燃烧法等。但是这些方法大多获得油溶性的UCNPs，其水溶性和生物相容性差，限制了其在生物医学等领域的应用，故需要在合成纳米颗粒之后对其表面进行修饰。常用的表面修饰的方法主要有表面钝化、表面配体氧化法、表面配体交换法、聚合物包裹法、二氧化硅包覆法、静电吸引层层组装包覆法(LBL)等。同时为了进一步将UCNPs应用于成像中，对UCNPs表面功能化是必要的步骤。目前，UCNPs表面往往含有-C00H，-NH2或嫩，然后可以进一步链接生物分子，如叶酸、肽、蛋白、DNA等。
[0006]癌症细胞表面比正常细胞多很多叶酸受体，而叶酸与叶酸受体能够特异性识别结合，因此，叶酸受体会与叶酸偶联的UCNPs产生特异性结合，并将UCNPs转运到细胞内，在980nm激发下，发出荧光，实现了靶向性识别检测。常规的叶酸偶联UCNPs的做法是先用PEI包覆UCNPs，然后通过EDC和NHS反应得到，过程复杂，成本高。例如中国发明专利CN201410169902.8首先将叶酸活化，然后将其加入到半胱氨酸改性的稀土上转换纳米晶水分散液中，并在常温常压避光条件下反应一定的时间，形成叶酸修饰的纳米晶，最后，将其分离纯化，即得到叶酸修饰的水溶性稀土上转换发光纳米晶。其中叶酸活化步骤是将叶酸、 EDC, NHS在避光条件下反应。
【发明内容】
[0007]本发明针对上述不足，制备了一种叶酸偶联的水溶性上转换纳米颗粒。
[0008]本发明通过下述技术方案予以实现:
(O首先采用高温热分解法合成六方相的上转换发光纳米颗粒UCNPs:将Immol的Ln (CF3COO) 3 (Ln = Y, Yb, Tm/Er)，1mmol 氟化钠(NaF)和 20ml 有机溶剂(10 ml 油酸OA/10 ml碳十八烯0DE)加入到50 mL三颈烧瓶中并加热到120°C，持续通入氮气保护并加热lh，然后以1° C/min的速度升温到320° C并磁力搅拌lh，自然冷却到室温，加入无水乙醇，以12000r/min的转速离心1min得到沉淀，再反复用水和乙醇洗涤，最终得到可溶解在环己烷等各种有机溶剂中的上转换纳米颗粒(UCNPs )。
[0009](2)将l-5g/L的5mL上转换发光纳米颗粒己烷分散溶液与0.1-0.6g/L的5mL四氟硼酸亚硝鎗NOBF4 二氯甲烷溶液在室温下混合，将混合物轻轻摇动，直至UCNPs沉淀，然后离心分离，除去上清液。
[0010](3)将步骤二中得到的上转换发光纳米颗粒重新分散于水中，按体积比1:1-1:10，加入0.01g/L-100g/L的端氨基超支化聚合物水溶液,超声反应10-120min,得到端氨基超支化聚合物修饰的UCNPs，以8000转/min的转速离心20min，用蒸馏水和乙醇多次洗涤，并在60° C干燥。
[0011](4)将步骤三中得到的10-50mg端氨基超支化聚合物修饰的UCNPs分散在1ml去离子水中，加入150-300mg的叶酸FA、100mg氢氧化钠，超声反应一段时间，离心分离，用蒸馏水和乙醇多次洗涤，干燥。
[0012]作为优选方案，所述步骤(I)中的Y:Yb:Er/Tm的摩尔比为69%-78%:20%-30%:1%_2%。
[0013]作为优选方案，所述步骤(I)制备的上转换纳米颗粒为六方相，粒径l-100nm。
[0014]作为优选方案，步骤(4)的超声时间为l_24h。
[0015]端氨基超支化聚合物的合成可参考下述公开文献:张峰，陈宇岳，张德锁，华琰蓉，赵兵.端氨基超支化聚合物及其季铵盐的制备与性能[J].高分子材料科学与工程，2009，25(8): 141-144 ;CN200710020794.8 —种超支化活性染料无盐染色助剂；Colorat1n technology, 2007，123(6): 351-357 ；AATCC REVIEW, 2010，10(6):56-60 ;B10MACR0M0LECULES，2010, 11(1): 245-251 ；CHEMICAL RESEARCH IN CHINESEUNIVERSITIES, 2005, 21(3): 345-354。
[0016]与现有技术相比，本发明的优点在于:本发明首先采用端氨基超支化聚合物取代上转换纳米颗粒表面的油酸，制备了一种水溶性好，发光强度高的上转换纳米颗粒。端氨基超支化合物是一种结构高度支化、溶解性能优异的超支化聚合物，比通常所使用的氨基酸、聚乙烯亚胺等具有更好的水溶性，表面含有更多的氨基-NH2。然后利用-NH2和-C00H反应将叶酸偶联到上转换纳米颗粒上。制备的叶酸偶联的水溶性上转换纳米颗粒具有良好分散性、生物相容性及靶向性等优点，可用于癌症细胞的靶向成像。
【具体实施方式】
[0017]下面结合【具体实施方式】，进一步阐述本发明。
[0018]实施例1:
将 0.78mmol 的 Y (CF3COO) 3、0.2mmol 的 Yb (CF3COO) 3、0.02mmol 的 Er (CF3COO)3, 1mmol氟化钠(NaF)和20ml有机溶剂(10 ml油酸OA+10 ml碳十八烯0DE)加入到50mL三颈烧瓶中并加热到120°C，持续通入氮气保护并加热lh，然后以1° C/min的速度升温到320° C并磁力搅拌lh，自然冷却到室温，加入无水乙醇，离心得到沉淀，再反复用水和乙醇洗涤，最终得到可溶解在环己烷等各种有机溶剂中的上转换纳米颗粒(UCNPs )。
[0019]将lg/L的5mL上转换发光纳米颗粒己烷分散溶液与0.6g/L的5mL四氟硼酸亚硝鎗NOBF4 二氯甲烷溶液在室温下混合，将混合物轻轻摇动，直至UCNPs沉淀，然后离心分离，除去上清液，再重新分散于水中，按体积比1:10，加入lg/L的端氨基超支化聚合物水溶液，超声反应30min，得到端氨基超支化聚合物修饰的UCNPs，离心分离，用蒸馏水和乙醇多次洗涤，并在60° C干燥。
[0020]将1mg端氨基超支化聚合物修饰的UCNPs分散在1ml去离子水中，加入150mg的叶酸FA、10mg氢氧化钠，超声反应5h，离心分离，用蒸馏水和乙醇多次洗涤，干燥。
[0021]实施例2:
将 0.69mmol 的 Y (CF3COO) 3、0.3mmol 的 Yb (CF3COO) 3、0.0lmmol 的 Er (CF3COO)3, 1mmol氟化钠(NaF)和20ml有机溶剂(10 ml油酸OA+10 ml碳十八烯0DE)加入到50mL三颈烧瓶中并加热到120°C，持续通入氮气保护并加热lh，然后以1° C/min的速度升温到320° C并磁力搅拌lh，自然冷却到室温，加入无水乙醇，离心得到沉淀，再反复用水和乙醇洗涤，最终得到可溶解在环己烷等各种有机溶剂中的上转换纳米颗粒(UCNPs )。
[0022]将2g/L的5mL上转换发光纳米颗粒己烷分散溶液与0.3g/L的5mL四氟硼酸亚硝鎗NOBF4 二氯甲烷溶液在室温下混合，将混合物轻轻摇动，直至UCNPs沉淀，然后离心分离，除去上清液，再重新分散于水中，按体积比1:1，加入5g/L的端氨基超支化聚合物水溶液，超声反应60min，得到端氨基超支化聚合物修饰的UCNPs，离心分离，用蒸馏水和乙醇多次洗涤，并在60° C干燥。
[0023]将20mg端氨基超支化聚合物修饰的UCNPs分散在1ml去离子水中，加入200mg的叶酸FA、10mg氢氧化钠，超声反应10h，离心分离，用蒸馏水和乙醇多次洗涤，干燥。
[0024]实施例3:
将 0.78mmol 的 Y (CF3COO) 3、0.2mmol 的 Yb (CF3COO) 3、0.02mmol 的 Tm(CF3COO)3, 1mmol氟化钠(NaF)和20ml有机溶剂(10 ml油酸0A+10 ml碳十八烯0DE)加入到50mL三颈烧瓶中并加热到120°C，持续通入氮气保护并加热lh，然后以1° C/min的速度升温到320° C并磁力搅拌lh，自然冷却到室温，加入无水乙醇，离心得到沉淀，再反复用水和乙醇洗涤，最终得到可溶解在环己烷等各种有机溶剂中的上转换纳米颗粒(UCNPs )。
[0025]将2g/L的5mL上转换发光纳米颗粒己烷分散溶液与0.6g/L的5mL四氟硼酸亚硝鎗NOBF4 二氯甲烷溶液在室温下混合，将混合物轻轻摇动，直至UCNPs沉淀，然后离心分离，除去上清液，再重新分散于水中，按体积比1:10，加入0.5g/L的端氨基超支化聚合物水溶液，超声反应30min，得到端氨基超支化聚合物修饰的UCNPs，离心分离，用蒸馏水和乙醇多次洗涤，并在60° C干燥。
[0026]将30mg端氨基超支化聚合物修饰的UCNPs分散在1ml去离子水中，加入250mg的叶酸FA、10mg氢氧化钠，超声反应12h，离心分离，用蒸馏水和乙醇多次洗涤，干燥。
[0027]实施例4:
将 0.69mmol 的 Y (CF3COO) 3、0.3mmol 的 Yb (CF3COO) 3、0.0lmmol 的 Tm(CF3COO)3, 1mmol氟化钠(NaF)和20ml有机溶剂(10 ml油酸OA+10 ml碳十八烯0DE)加入到50mL三颈烧瓶中并加热到120°C，持续通入氮气保护并加热lh，然后以1° C/min的速度升温到320° C并磁力搅拌lh，自然冷却到室温，加入无水乙醇，离心得到沉淀，再反复用水和乙醇洗涤，最终得到可溶解在环己烷等各种有机溶剂中的上转换纳米颗粒(UCNPs )。
[0028]将5g/L的5mL上转换发光纳米颗粒己烷分散溶液与0.lg/L的5mL四氟硼酸亚硝鎗NOBF4 二氯甲烷溶液在室温下混合，将混合物轻轻摇动，直至UCNPs沉淀，然后离心分离，除去上清液，再重新分散于水中，按体积比1:1，加入20g/L的端氨基超支化聚合物水溶液，超声反应90min，得到端氨基超支化聚合物修饰的UCNPs，离心分离，用蒸馏水和乙醇多次洗涤，并在60° C干燥。
[0029]将50mg端氨基超支化聚合物修饰的UCNPs分散在1ml去离子水中，加入300mg的叶酸FA、10mg氢氧化钠，超声反应20h，离心分离，用蒸馏水和乙醇多次洗涤，干燥。
[0030]显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无法对所有的实施方式予以穷举。凡是属于本发明的技术方案所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。
【权利要求】
1.一种叶酸偶联的水溶性上转换纳米颗粒及其制备方法，其特征在于: 步骤一，将 Immol 的 Ln(CF3COO)3 (Ln = Y, Yb, Tm/Er), 1mmol 氟化钠(NaF)和 20ml有机溶剂(10 ml油酸0A/10 ml碳十八烯ODE)加入到50 mL三颈烧瓶中并加热到120。。，持续通入氮气保护并加热lh，然后以一定的升温速率升至320°C并磁力搅拌lh，自然冷却到室温，加入无水乙醇，离心得到沉淀，再反复用水和乙醇洗涤，最终得到可溶解在环己烷等各种有机溶剂中的上转换纳米颗粒(UCNPs)； 步骤二，将l_5g/L的5mL上转换发光纳米颗粒己烷分散溶液与0.1-0.6g/L的5mL四氟硼酸亚硝鎗NOBF4 二氯甲烷溶液在室温下混合，将混合物轻轻摇动，直至UCNPs沉淀，然后离心分离，除去上清液； 步骤三，将步骤二中得到的上转换发光纳米颗粒重新分散于水中，按体积比1:1-1:10，加入0.01g/L-100g/L的超支化聚合物水溶液，超声反应10-120min，得到超支化聚合物修饰的UCNPs，离心分离，用蒸馏水和乙醇多次洗涤，并在60° C干燥； 步骤四，将步骤三中得到的10-50mg超支化聚合物修饰的UCNPs分散在1ml去离子水中，加入150mg的叶酸FA、10mg氢氧化钠，超声反应一段时间，离心分离，用蒸馏水和乙醇多次洗漆，干燥。
2.根据权利要求1所述的一种叶酸偶联的水溶性上转换纳米颗粒及其制备方法，其特征在于，步骤一所述的Y:Yb:Er/Tm的摩尔比为69%_78%:20%_30%: 1%_2%。
3.根据权利要求1所述的一种水溶性上转换纳米颗粒的制备方法，其特征在于，步骤一所述的升温速率为1° C/min。
4.根据权利要求1所述的一种水溶性上转换纳米颗粒的制备方法，其特征在于，步骤一制备的上转换发光纳米颗粒为六方相，粒径l-100nm。
5.根据权利要求1所述的一种水溶性上转换纳米颗粒的制备方法，其特征在于，步骤三所述的亲水性超支化聚合物为端氨基超支化聚合物。
6.根据权利要求1所述的一种水溶性上转换纳米颗粒的制备方法，其特征在于，步骤四所述的超声时间为l_24h。
【文档编号】C09K11/85GK104371728SQ201410702168
【公开日】2015年2月25日 申请日期:2014年11月28日 优先权日:2014年11月28日
【发明者】赵兵 申请人:赵兵