具有靶向肿瘤功能的荧光素衍生物光敏剂的合成和生物应用的制作方法

本发明属于医药领域，涉及一类具有靶向肿瘤功能的荧光素衍生物光敏剂的制备方法和生物应用，该化合物具有比较好的单线态氧生成能力，可作为优良的光敏剂应用于肿瘤的靶向和光动力学治疗。

背景技术：

癌症已成为威胁人类生命和健康的主要疾病之一，如何有效的检测和治疗癌症是全世界一直关注的重要课题。

肿瘤细胞由于具有无限增值、逃避生长抑制、逃避免疫攻击、无限复制、抵抗细胞凋亡等特性使得肿瘤的诊断和治疗比较棘手，同时由于肿瘤细胞与正常细胞有这些不同，使得肿瘤细胞会有一些特异性的标记物，比如肿瘤新生血管上的膜糖蛋白、细胞表面的叶酸受体、，以及几种实体肿瘤细胞表面及几乎所有肿瘤新生血管中特异性表达的整合素αvβ3等，很多科研工作者设计了一些基于肿瘤表面特异性的受体和荧光团结合的荧光诊断分子，它们会对肿瘤细胞有一个高度特异性选择性。

当肿瘤被诊断后，下一个被考虑的问题为肿瘤的治疗方法，手术切除肿瘤往往伴随着较高的复发率，放射治疗受到辐射剂量以及损害正常组织的限制，而化疗极易诱发全身毒副作用。光动力疗法(pdt)是近20年出现的新的治疗手段，在氧气存在下用合适波长的光照射光敏剂能产生具有高度活性单线态氧，从而消灭病变的癌细胞。单线态氧攻击目标细胞，通过直接的细胞损伤、血管封闭和对靶细胞激活免疫反应造成细胞死亡。光动力学治疗，作为一种基础的疗法，它主要具有以下优点：

(1)主要破坏癌细胞，不损伤正常细胞；

(2)光敏剂无毒性，安全，不会抑制人的免疫功能，也不会抑制骨髓而引起白细胞、红细胞和血小板减少；

(3)与手术、放疗和化疗有相辅相成作用，可以同时使用；

(4)可作多疗程给药，不会产生耐药性；

(5)治疗时间短，一般48-72小时后即产生疗效。

技术实现要素：

本发明解决的技术问题是提供了一类具有靶向肿瘤功能的荧光素衍生物光敏剂的合成方法和生物应用，该方法是通过傅-克反应获得衍生化的荧光素母体结构，在此基础上通过duff反应上醛，然后通过knoevenagel-缩合反应获得染料母体，然后通过链接不同的肿瘤标记物l获得具有肿瘤高度选择性的长寿命荧光素衍生物，具有比较好的生物应用前景。

本发明的技术方案如下：

本发明首先提供一类结构式(ⅰ)的具有靶向肿瘤功能的荧光素衍生物光敏剂，其特所述结构包含不同的肿瘤靶向标记物l链接染料母体，它们均能高效的进入特有标记物的肿瘤细胞，并且通过光动力疗法，特异性的对肿瘤进行治疗。该荧光素衍生物具有如下结构式(ⅰ)：

其中：

r0，r0’分别独立选自f、cl、br、i卤族元素；

r，r’分别独立选自r1、r2、r3和r4；

l选自l1，l2；

本发明还提供一种制备所述的化合物(i)的方法，所述方法包括以下步骤：

(1)将对醛基苯甲酸和四氯间苯二酚溶解在具有酸性的有机溶剂中，对醛基苯甲酸与四氯间苯二酚摩尔比为1:2，加热至80-140℃回流8-12h，反应溶液冷却到室温后缓慢加入弱碱性碱溶液中，抽滤、水洗三次后干燥，得到式(ⅱ)化合物；

(2)在常温状态下，将式(ⅱ)化合物和乌洛托品溶解在极性有机溶剂中，式(ⅱ)化合物与乌洛托品化合物的投料摩尔比为1:(5～10)；加热到70～90℃回流12-24h，反应溶液冷却到室温后加入酸溶液，抽滤后获得化合物(ⅲ)，水洗后干燥，不经提纯直接进行下一步反应；

(3)在氮气气氛中，将化合物(ⅲ)溶解在有机溶剂中，然后向其中加入r中间体，化合物ⅲ和中间体r按照摩尔比1:(3～5)反应，然后按照化合物ⅲ与哌啶的摩尔比1:(2～6)的比例，将哌啶加入反应体系中制备化合物(ⅳ)，在氮气保护下80-100℃回流12-24h。反应冷却到室温后减压蒸馏、纯化后得到化合物(ⅳ)；

(4)在氮气气氛中，将化合物(ⅳ)、l、2-(7-偶氮苯并三氮唑)-n，n，n’,n’-四甲基脲六氟磷酸酯(hatu)、n，n-二异丙基乙胺(diea)按照摩尔比1:(1～5)：(1～3):(1～20)加至无水dmf中，搅拌均匀，在0℃保持10min后，于室温(20-25℃)下反应24h，获得最终式(i)产品；

基于以上技术方案，优选的，步骤(1)所述的酸性有机溶剂为甲基磺酸，三氟乙酸中至少一种；

步骤(1)所述的弱碱性溶液为0℃下的饱和碳酸钠、饱和碳酸氢钠、饱和碳酸钾、饱和碳酸氢钾中至少一种。

基于以上技术方案，优选的，步骤(2)所述极性有机溶剂选自三氟乙酸、二氯甲烷、氯仿、乙醇、乙腈、乙酸乙酯、甲苯、二甲苯、邻-二氯苯中至少一种；

步骤(2)所述的酸溶液选自盐酸或者乙酸水溶液；所述酸溶液浓度范围为1.0-3.0m。

基于以上技术方案，优选的，步骤(2)所述极性有机溶剂为三氟乙酸、二氯甲烷、氯仿、乙醇、乙腈、乙酸乙酯、甲苯、二甲苯、邻-二氯苯中至少一种；

步骤(2)所述的酸溶液为盐酸或乙酸水溶液；所述酸溶液浓度为1.0-3.0m。

基于以上技术方案，优选的，步骤(3)所述有机溶剂选自甲醇、乙醇、乙腈、甲苯、二甲苯、邻-二氯苯之中的至少一种。

基于以上技术方案，优选的，步骤(3)所述的r中间体为r1’(c10h8n2o)、r2’(c8h8o)、r3’(c6h6os)、r4’(c11h9n3o)中的至少一种，所述r中间体即为上述r1、r2、r3和r4脱除双键后对应的物质，

基于以上技术方案，优选的，步骤(3)所述纯化的步骤为，减压蒸馏去除溶剂后，加入少量甲醇、dmf、dmso等溶解反应产品，在大量的乙醚中析出，抽滤获得滤饼，采用柱色谱法，液相色谱的流动相为甲醇与二氯的体系。

本发明另一方面提供一种包括上述化合物的光敏剂。

本发明再一方面提供所述的一类的荧光素衍生物化合物(ⅰ)在制备优良的肿瘤的靶向和光动力学治疗的光敏剂的应用。

有益效果

本发明所述的荧光素衍生物是利用不同的肿瘤标记物与具有长寿命三重态的荧光素衍生物链接，具有靶向肿瘤诊断及光动力治疗的效果，可以作为一种比较优良的诊疗一体化分子应用于生物检测过程。同时，由于本发明的荧光素衍生物可以通过系间窜越(isc)过程生成长寿命的三重激发态，能量可以从三重激发态传递到三线态氧分子从而发生三重态-三重态能量传递过程(ttet)过程，产成具有诱导细胞凋亡的单线态氧分子¹o2，可以作为优良的光敏剂在肿瘤的靶向和光动力学治疗中有广泛的应用前景。

附图说明

图1为实施例1合成的具有肿瘤靶向功能的荧光素衍生物光敏剂fl-rgd的质谱表征图。

图2为实施例1合成的具有肿瘤靶向功能的荧光素衍生物光敏剂fl-rgd的核磁共振氢谱表征图。

图3为实施例1合成的具有肿瘤靶向功能的荧光素衍生物光敏剂fl-rgd的纳秒瞬态吸收光谱图。

图4为实施例1中合成的具有肿瘤靶向功能的荧光素衍生物光敏剂fl-rgd的共聚焦荧光成像。

图5为实施例1中合成的具有肿瘤靶向功能的荧光素衍生物fl-rgd光敏剂的单线态氧产生能力。

具体实施方式

下述非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思进行等同替换或改变均属于本发明保护范畴。

下述实施例中，如无特殊说明，所用试剂均和药品均可由商业途径购买，其中中间体r的合成参考文献方法合成，r1’(c10h8n2o)参考文献[1]xiong,x.,song,f.,sun,s.,etal.red-emissivefluoresceinderivativesanddetectionofbovineserumalbumin[j].asianjournaloforganicchemistry,2013,2:145-9.合成；r2’(c8h8o)和r3’(c6h6os)参考文献[2]wu,y.,song,f.,luo,w.,etal.enhancedthermallyactivateddelayedfluorescenceinnewfluoresceinderivativesbyintroducingaromaticcarbonylgroups[j].chemphotochem,2017,1:79-83.合成；r4’(c11h9n3o)参考文献[3]an,j.；wu,y.；luo,w.；etal.long-wavelengthchromophoreswiththermallyactivateddelayedfluorescencebasedonfluoresceinderivatives[j].journalofphotonicsforenergy,2018,8:032103.合成。

实施例1

具有肿瘤靶向的荧光素衍生物光敏剂fl-rgd的合成路线：

(1)中间体ⅱ的合成

常温下，将对醛基苯甲酸和四氯间苯二酚溶解在甲基磺酸溶剂中，对醛基苯甲酸与四氯间苯二酚摩尔比为1:2，反应溶液加热至90℃回流12h，冷却反应溶液到室温，缓慢加入到0℃的饱和碳酸氢钠溶液中，抽滤、水洗三次后干燥，得到式(ⅱ)化合物。

(2)中间体ⅲ的合成

在常温状态下，将ⅱ(1.0g,2.5mmol)和乌洛托品(1.752g，12.5mmol)溶解在25ml三氟乙酸的圆底烧瓶中。加热至90℃回流24h，反应溶液冷却后加入25ml盐酸水溶液(2m)，放入冰箱中冷却有固体析出，在布氏漏斗中抽滤滤饼获得化合物ⅲ，水洗三次后干燥，得到橘红色固体，不经提纯直接进行下一步反应。

(3)中间体fl的合成

氮气气氛中，将化合物ⅲ(0.456g,1mmol)溶解在15ml无水乙醇的溶剂中，然后向其中加入中间体r1’(0.688g，4mmol)，混合物搅拌均匀后加入哌啶(0.4ml)，在氮气保护下加热回流24h。反应体系降低到室温后减压蒸馏去除溶剂，加入少量甲醇溶解反应产品，在大量的乙醚中析出，在布氏漏斗中抽滤获得滤饼，采用柱色谱法(甲醇/二氯的体系＝1/10)纯化化合物fl。

(4)化合物fl-rgd的合成

氮气气氛中，将化合物fl(16mg,0.0209mmol)，2-(7-偶氮苯并三氮唑)-n,n,n’,n’-四甲基脲六氟磷酸酯(hatu,15.89mg,0.0418mmol)和n,n-二异丙基乙胺(54.03mg,0.418mmol)和rgd(14.4mg,0.0209mmol)溶解在10ml无水dmf中，0℃保持1h后室温反应24h，将反应产品放入大量的乙醚中析出，在布氏漏斗中抽滤获得滤饼，采用柱色谱法(甲醇/二氯的体系＝1/10)纯化得到化合物fl-rgd，化合物fl-rgd为本发明保护化合物中的一种。

图1为实施例1合成的具有肿瘤靶向功能的荧光素衍生物光敏剂fl-rgd的质谱表征图。

图2为实施例1合成的具有肿瘤靶向功能的荧光素衍生物光敏剂fl-rgd的核磁共振氢谱表征图。

图3为实施例1合成的具有荧光素母体fl(a)和其衍生物fl-rgd(b)的纳秒瞬态吸收。fl-rgd保持了染料母体延迟荧光的特性，具有长寿命的三重态。

实施例2

将实施例1制备的fl-rgd和商业化光敏剂原卟啉(ppix)进行单线态产氧的测试，具体方法如下：选取单线态氧指示剂1，3二苯基异苯并呋喃(dpbf)作为单线态氧指示剂，将相同浓度的化合物fl，fl-rgd或者ppix溶解在含有dpbf的乙腈溶液中，溶液总体积为3ml，光动力过程的光源为630nm的led光源，在光照过程中反应溶液一直处于搅拌状态，光照一定的时间，记录吸收强度随时间的变化。

图4为实施例1中合成的荧光素衍生物fl-rgd对整合素αvβ3表达水平不同的四种细胞的共聚焦荧光成像。a通道为商业化细胞核染料的通道，b通道为fl-rgd染料的通道。由于rgd可以特异性的与肿瘤表面的整合素αvβ3结合，rgd的链接使得其对过表达整合素αvβ3的u87mg细胞和skov-3细胞有高效的选择性，所以在b通道有荧光信号。而对不表达整合素αvβ3的mcf-7细胞和raw-264.7细胞没有选择性，不能进入细胞中，所以在b通道没有荧光信号。这些结果表明fl-rgd对整合素αvβ3过表达的肿瘤细胞具有比较好的诊断效果。

图5为实施例1中合成的荧光素衍生物fl-rgd的单线态氧产生能力对比图。(a)化合物fl存在下dpbf的衰减曲线，(b)染料fl-rgd存在下dpbf的衰减曲线，(c)化合物fl、fl-rgd和商业化光敏剂原卟啉(ppix)单线态氧生成速率的对比；选用1,3-二苯基异苯并呋喃(dpbf)作为¹o2捕捉剂，dpbf因被¹o2氧化而消耗，导致其在410nm处的强吸收减弱，以此监测dpbf在410nm处吸收强度的变化来评价荧光素衍生物fl-rgd的单线态氧的产生能力。fl-rgd比商业化的光敏剂卟啉(ppix)有更好的单线态氧产生能力。

结果表明：荧光素衍生物fl-rgd具有特异性的选择整合素αvβ3过表达的肿瘤细胞，同时具有比较好的光动力治疗效果，具有诊疗一体化的潜力。