专利名称：一株多环芳烃降解菌及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于环境污染物生物处理技术领域，具体涉及一株降解多环芳烃的细菌及其在废水生物处理和环境污染修复中的应用。
背景技术：
多环芳烃(PAHs)是指两个或两个以上的苯环以链状、角状或串状排列组成的化合物，是有机质不完全燃烧或高温裂解的副产品。环境中的PAHs主要来源于人类活动，如木材加工、石油冶炼、运输业、煤气制造、军事设施、危险物处理和填埋地等。PAHs在环境中的含量虽然微量但是分布广泛，在大气、水体、土壤、沉积物和食品中都检测到多种PAHs的存在。许多PAHs不仅具有强烈的“三致”毒性——致癌、致畸和致突变性，还有促致癌作用。美国环保局(USEPA)在上个世纪80年代就将16种未带分支的PAHs列入了环境优先污染物的黑名单。PAHs的低水溶性和高亲脂性使其比较容易分配到生物体内，通过食物链进入生态系统，从而对人类健康和生态系统的安全构成极大的危害。
由于PAHs化学稳定性很好，自然条件下很难通过水解等化学作用分解，除了会有很少一部分发生光化学分解外，绝大部分的多环芳烃主要是通过生物降解途径从环境中慢慢消失的。因此，利用微生物的降解作用将PAHs转化为无害物质被认为是去除环境中PAHs的最佳手段。
目前，人们通过人工富集培养等技术，已经分离出许多具有降解PAHs的能力的细菌、真菌和放线菌，细菌由于其生化上的多种适应能力及易诱发突变株而占主要地位。但是已分离到的PAHs降解菌中高效菌种不多，如Tam等分离的菌株SKY对10mg/L的菲6天只降解了46％；Romero等研究的两种菌株Rhodotorula glutinis和Pseudomonas aeruginosa要一个月才能完全降解25、50、100、200mg/L几种浓度的菲；Yuan等研究混合菌中分离的六种单菌均需要6-8天才能完全降解5mg/L菲。另一方面，已分离到的PAHs降解菌中大多数只针对单一污染物，很少涉及其降解底物范围的研究。因此，寻找高效广谱的降解菌是目前环境保护研究的热点问题。
发明内容
本发明的目的是针对上述现有降解多环芳烃存在的难题，提供一种能高效降解多环芳烃的菌种。
本发明的另一个目的是提供上述菌种在降解各种有机化合物中的应用。
本发明所提供的高效降解菌Sphingomonas sp.GY2B来源于广州油制气厂附近受石化产品污染的土壤，经人工富集培养、分离纯化得到。该菌是革兰氏染色阴性的鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas sp.)的菌株GY2B，生物学特性为触酶阳性，氧化酶阴性，非发酵型，专性需氧，菌体形态为无芽孢杆菌，菌落呈乳黄色、圆形、边缘整齐、光滑湿润，菌株16S rDNA的GenBank登陆号为DQ139343，于2006年2月24日在中国典型培养物保藏中心保藏，编号为CCTCC M 206019。
该菌的最适生长条件为pH＝6.5～9.5，温度25～35℃。
该菌能利用菲作为唯一碳源和能源生长繁殖，将菲完全矿化成CO2和H2O。在纯培养条件下，该菌48h能将无机盐培养基中100mg/L的菲降解99.1％以上。如果添加适量的葡萄糖、蛋白胨等营养物质可提高该菌降解菲的效率。另外，该菌能分别利用萘、2-萘酚、1-羟基-2-萘酸等多环芳烃及取代物作为唯一碳源和能源生长繁殖，同时将其降解。对于含有苯环的物质，该菌能分别利用苯、甲苯、水杨酸、邻苯二酚、苯酚等苯系物作为唯一碳源和能源生长繁殖，同时将其降解。
该菌对头孢呋辛、氯霉素、红霉素、四环素四种常用抗生素敏感，对羟氨苄青霉素中度敏感。
与现有技术相比，本发明的Sphingomonas sp.GY2B可在好氧条件下分别以菲、萘、2-萘酚、1-羟基-2-萘酸等多环化合物和苯、甲苯、水杨酸、邻苯二酚、苯酚等苯系物作为唯一碳源和能源生长繁殖，同时将其降解。在纯培养条件下，它能将100mg/L的菲在48h内降解99.1％以上。该菌对头孢呋辛、氯霉素、红霉素、四环素等四种常用抗生素敏感，对羟氨苄青霉素中度敏感，可以认为当菌体被释放到自然环境中时，不会同时携带耐药因子在土著菌间传播。与已有菌株相比，该菌具有高效降解菲的能力，并且能利用多种底物，不携带耐药因子，将可得到安全、广泛的应用。该菌将在工业废水的生物处理和污染环境的生物修复中发挥重要作用。
图1为Sphingomonas sp.GY2B生长与菲的降解曲线图；图2为Sphingomonas sp.GY2B降解25mg/L不同底物的UV-Vis图谱。其中，图1中各条曲线代表的意义为-◆-培养液中菲的残留率，-□-培养液中GY2B的菌密度；图2中各条曲线代表的意义为——底物加菌降解2d后的扫描图谱；——底物不加菌的扫描图谱。
具体实施例方式
以下结合具体实施例来对本发明作进一步说明。
实施例1Sphingomonas sp.GY2B的分离与降解菲的性能现场采集广州油制气厂周边受石化产品污染的土壤，采用水-硅油(体积比4∶1)双相体系驯化菲降解菌，菲起始浓度保持100mg/L。水相无机盐培养液(MSM)成分5.0ml/L磷酸盐缓冲液(8.5g/L KH2PO4，21.75g/L K2HPO4·H2O，33.4g/L Na2HPO4·12H2O，5.0g/L NH4)C)，3.0ml/LMgSO4水溶液(22.5g/L)，1.0ml/LCaCl2水溶液(36.4g/L)，1.0ml/L FeCl3水溶液(0.25g/L)，1.0ml/L微量元素溶液(39.9mg/L MnSO4·H2O，42.8mg/L ZnSO4·H2O，34.7mg/L(NH4)6Mo7O24·4H2O)。
经过若干代反复驯化，在固体培养基(NR)中划线培养，得到多株纯菌，纯菌经过接种至液体培养基中验证其降解菲的能力，最后得到一株菲的高效降解菌GY2B，该菌经16S rDNA鉴定为鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas sp.)。NR成分蛋白胨10g，牛肉膏5g，NaCl 5g，琼脂条15g，蒸馏水1L，调pH为7.0。
将Sphingomonas sp.GY2B接种至含菲100mg/L的MSM培养基中，在150r/min、30℃摇床中避光振荡培养，在第0、6、12、24、30、36、48h分别取样测定培养液中菌密度和菲残留率，实验结果见图1。由图1的菲降解曲线可以看出，在100mg/L的初始浓度下，开始阶段(0-6h)菲的降解较缓慢，接下来的6-30h之间菲的降解非常快，到48h的时候，菲的降解率已经达到99.1％。另外，图1的细胞生长曲线表明降解初期细胞生长有一点缓慢，之后的生长较快，48h的时候菌密度达到4.2×108个/mL。从菲降解曲线计算得出菲在线性下降期(6-30h)的降解率是3.45mg/L·h；从细菌生长曲线计算得出GY2B在对数生长期(6-24h)的比生长速率μ为0.135h-1，细胞倍增时间t为5.1h。
本实施例说明分离所得到的Sphingomonas sp.GY2B可利用菲作为唯一碳源和能源进行生长繁殖，并且具有高效降解菲的能力。
实施例2添加营养物质对Sphingomonas sp.GY2B细胞生长与菲降解率的影响将Sphingomonas sp.GY2B接种至含菲100mg/L的MSM培养基中，然后在培养液中添加100mg/L的葡萄糖或蛋白胨作为营养物质，同时做不添加营养物质、只接种菌不加碳源、不接种菌只加菲等对照实验。在150r/min、30℃摇床中避光振荡培养，36h后测定培养液中菌密度和菲残留量，计算菲的降解率，实验数据见表1。从表1可知，菲的非生物降解作用非常小；添加了蛋白胨或葡萄糖的培养液中菌密度显著增加，菲的降解率也得到提高。
本实施例说明添加适量营养物质可促进Sphingomonas sp.GY2B的生长，同时提高它对菲的降解率。
表1添加营养物质对Sphingomonas sp.GY2B细胞生长与菲降解率的影响
实施例3Sphingomonas sp.GY2B的降解底物实验将Sphingomonas sp.GY2B接种至含不同浓度(25～2000mg/L，见表2)的水杨酸、邻苯二酚、1-羟基2-萘酸、苯酚、2-萘酚、萘、苯、甲苯等底物的MSM培养基中，同时设底物空白对照(只加底物不加菌)，在150r/min、30℃摇床中避光振荡培养2天后测定生物量和检测底物的降解情况。Sphingomonas sp.GY2B的生长情况见表2，结果表明Sphingomonas sp.GY2B能利用一定浓度的实验底物进行生长繁殖，对且不同底物的耐受浓度不同，除2-萘酚耐受浓度较低外，其余底物的耐受浓度至少达到100mg/L。培养2天后观察到初始时以固体或油状漂浮在培养液中的萘、苯、甲苯消失，而初始就溶于MSM培养基中的水杨酸、邻苯二酚、1-羟基2-萘酸、苯酚、2-萘酚则通过UV-Vis检测培养液中其存在，检测结果见图2。初始浓度为25mg/L的水杨酸、邻苯二酚、1-羟基2-萘酸、苯酚、2-萘酚培养2天后UV-Vis吸收峰都消失了，表明它们已被Sphingomonas sp.GY2B降解完全。
本实施例表明Sphingomonas sp.GY2B具有降解多种底物的能力，是一株广谱的降解菌。
表2菌株GY2B降解底物的多样性
注++表示生长好，数量比初始菌密度高一个数量级以上；+表示可以生长，数量和初始菌密度在同一个数量级；+/-仅有少量生长，数量比初始菌密度低一个数量级以上；-表示不能生长；ND表示没做此浓度的实验。
实施例4Sphingomonas sp.GY2B的抗生素敏感性实验抗生素敏感试验采用纸片法，选择羟氨苄青霉素、头孢呋辛、氯霉素、红霉素、四环素等五种常用的代表性抗生素，以各个抗生素纸片在培养降解菌NR平板上的抑菌直径大小，作为敏感或者耐药的判定标准。表3给出的实验结果表明，菌株GY2B对头孢呋辛、氯霉素、红霉素、四环素等四种常用代表性抗生素敏感，对羟氨苄青霉素中度敏感。
本实施例说明当菌体被释放到自然环境中时，不会因携带耐药因子而在土著菌间传播，为Sphingomonas sp.GY2B的实际应用提供了理论基础和安全保证。
表3菌株GY2B的抗性试验结果
注①抑制圈的直径大于中度敏感范围的上限值为敏感(-)，小于下限值为抗药(+)，在此值之间为中度敏感(○)。
权利要求
1.一株多环芳烃降解菌，其特征在于该菌是革兰氏染色阴性的鞘氨醇单胞菌属的菌株GY2B，生物学特性为触酶阳性，氧化酶阴性，非发酵型，专性需氧，菌体形态为无芽孢杆菌，菌落呈乳黄色、圆形、边缘整齐、光滑湿润，菌株16SrDNA的GenBank登陆号为DQ139343，于2006年2月24日在中国典型培养物保藏中心保藏，编号为CCTCC M 206019。
2.权利要求1所述多环芳烃降解菌在降解有机芳香化合物中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于所述有机化合物为多环芳烃类化合物或苯系物。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于所述多环芳烃类化合物为菲、萘、2-萘酚或1-羟基-2-萘酸。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于所述苯系物为苯、甲苯、水杨酸、邻苯二酚或苯酚。
全文摘要
本发明公开了一株多环芳烃降解菌及其应用。本发明所提供的多环芳烃高效降解菌是鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas sp.)的菌株GY2B，该菌可在好氧条件下高效降解菲，并且能利用萘、2－萘酚、1－羟基－2－萘酸、苯、甲苯、水杨酸、邻苯二酚、苯酚等其它多种芳香有机物。Sphingomonas sp.GY2B对头孢呋辛、氯霉素、红霉素、四环素四种常用抗生素敏感，对羟氨苄青霉素中度敏感，为其在废水生物处理和环境污染修复中的应用提供了安全保证。
文档编号C02F3/34GK1844361SQ200610034169
公开日2006年10月11日 申请日期2006年3月8日 优先权日2006年3月8日
发明者党志, 陶雪琴, 卢桂宁, 易筱筠, 杨琛 申请人:华南理工大学