专利名称：一种适于蛋白纯化的壳聚糖分离介质的制备方法
技术领域：
本发明属于天然高分子材料技术领域，具体涉及一种适于蛋白纯化的壳聚糖分离 介质的制备方法。
二.
背景技术：
目前虽然用于蛋白分离的方法很多，但金属螯合层析(IMAC)具有螯合介质制备 简单方便、交换载量大、分离条件温和、通用性强、易于放大，特别是在蛋白的纯化过程中， 其温和的洗脱条件，可较好的保持蛋白的生物学活性等优点，使得其应用越来越受到重视， 将成为蛋白质分离纯化中最具潜力的层析方法。但常规的金属螯合层析(IMAC)层析柱大多以葡聚糖或琼脂糖等软基质作载体， 一方面这些介质多为进口，价格昂贵，其制备技术均已被国外一些生物制品大公司所垄断； 另一方面，这些介质在使用过程中金属离子容易泄漏，导致蛋白分离纯度的下降。因而国内 外学者一直在寻找价廉、亲水性好、刚性强的IMAC载体。壳聚糖是迄今为止发现的唯一天 然碱性多糖，结构及性能与琼脂糖、葡聚糖相似，资源丰富，生物相容性较好，其分子中含有 活性胺基(-NH2)和羟基(-0H)，易于衍生化得到具有各种不同吸附性能的多孔性材料，可直 接或经修饰后作为各种层析和蛋白质分离纯化的载体。天然状态的壳聚糖大部分为粉末状，比表面积小，作为吸附载体，则使载体和吸附 物都难以回收，从而限制其应用。因此，将壳聚糖制备成单分散的窄分布高分子微球，使壳 聚糖和高分子微球的功能相符合，使其在生物医学等领域得到更大的应用。近年，有关多孔壳聚薄膜和微球的研究已有文献报道，壳聚糖研究发展迅速，但多 数研究集中在用壳聚糖修饰脂质体、微球、微囊等递药系统，而将其作为分离介质的报道并 不多，且制备的壳聚糖分离介质条件不稳定，且吸附载量不高等问题。
三.
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种适于蛋白纯化的壳聚糖分离介质的制备方法。为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案一种适于蛋白纯化的壳聚糖分离介质的制备方法，包括如下步骤(1)壳聚糖骨架的制备在搅拌下，将壳聚糖的乙酸溶液分散于液体石蜡中，在制 孔剂环己烷和少许span 80存在下，形成壳聚糖微粒；然后在交联剂戊二醛的作用下，壳聚 糖微粒进一步交联形成壳聚糖骨架；(2)壳聚糖接枝壳聚糖骨架先进行溶胀处理；然后在DMSO/NaOH混合液中，壳聚 糖骨架上的羟基与环氧氯丙烷反应，在壳聚糖骨架上引入环氧基，得到接枝后的壳聚糖骨 架；(3)壳聚糖分离介质的制备将IDA/NaOH混合溶液加入接枝后的壳聚糖骨架， 20 80°C温度下反应1 10h，抽滤即得所述的壳聚糖分离介质；所述IDA/NaOH混合溶液中，IDA浓度为0. 5 3. Omo 1/L，NaOH浓度为0. 5 3. Omol/L。其中IDA即亚氨基二乙酸。本发明步骤(1)利用反相悬浮聚合法制备具有凝胶孔、珠状结构的壳聚糖骨架。 进一步，本发明具体推荐所述的步骤(1)按照如下进行将壳聚糖溶解在质量分数为1.0 3. 0%的醋酸溶液中配制得到浓度为0. 01 0. 05g/mL的壳聚糖溶液；在反应容器中依次加 入液体石蜡(油相)、环己烷和少许Span 80，搅拌30 60min后加入配制得到的壳聚糖溶 液(水相)，加热至20 80°C搅拌0.5 1.5h;然后加入戊二醛，调节pH至8 12，然后 升温至30 80°C，继续反应2 他，趁热抽滤、洗涤、干燥得到壳聚糖骨架；所述壳聚糖溶 液与液体石蜡的投料体积比为1 0.5 5，优选为1 1 3 ；所述交联剂戊二醛与壳聚 糖氨基的摩尔比为1 0. 1 10，优选为1 0.5 3;所述制孔剂环己烷与液体石蜡的投 料体积比为5 50 100，优选为10 30 100。所述span 80的用量只需少许即可，如 以IOOmL液体石蜡计，只需加入5-10滴span 80即可。进一步，步骤(1)中，优选加热至50 60°C搅拌0.5 l.Oh;然后加入戊二醛，调 节pH至9 10，然后升温至60 70°C，继续反应2. 5 4h。本发明步骤( 对步骤(1)制得的壳聚糖骨架进行活化，在壳聚糖骨架上引入环 氧基。进一步，本发明具体推荐所述的步骤( 按照如下进行称取壳聚糖骨架，经水充 分溶胀后，依次用10% 100%梯度浓度的二甲基亚砜溶液清洗；向处理后的产物中加入 DMSO/NaOH溶液和环氧氯丙烷，在20 80°C振荡反应1 10h，反应结束后用蒸馏水清洗， 直至清洗液中无环氧基检出；所述DMSO/NaOH混合液由DMSO与0. 1 1. 0mol/L的NaOH水 溶液按照体积比1 0.1 10.0配制得到，优选按照体积比1 0.5 2.0配制得到；所 述环氧氯丙烷与DMSO/NaOH混合液的投料体积比为1 20 100，优选为5 15 100。进一步，步骤(2)中，优选在40 50°C振荡反应，反应时间优选3 证。在上述方法中，壳聚糖骨架上环氧基密度可以通过硫代硫酸钠法进行测定。本发明步骤(3)中，所述IDA/NaOH混合溶液中，IDA浓度优选lmol/L，NaOH浓度 优选lmol/L。步骤(3)的反应温度优选55 65°C，反应时间优选3 他。与现有技术相比，本发明的有益效果在于本发明所述的壳聚糖分离介质制备方 法操作简单，且粒度均一性明显提高，具有非常强的耐酸耐碱性能，且具有更多的氨基，对 金属离子具有更强的螯合能力，环氧基修饰密度可达到0. lmmol/g, Cu2+螯合量明显提高， 在很大程度上解决了金属离子泄露的问题，BSA最大吸附量可达到128mg/g，具有工艺稳定 性及重现性好等优点，适宜规模化生产。
四.
图1是本发明制备的壳聚糖分离介质的分子结构示意图。图2是本发明制备的壳聚糖分离介质的扫描电镜图。图3是本发明制备的壳聚糖分离介质的粒径分布图。
五.
具体实施例方式下面以具体实施例对本发明的技术方案做进一步说明，但本发明的保护范围不限 于此实施例1壳聚糖骨架的制备
将3. Og壳聚糖(分子量为30000Da，脱乙酰度彡95% )溶解在IOOmL质量分数为 2. 0 %的醋酸溶液中，室温下静置过夜，备用。于装有机械搅拌器及温度计的500mL三口瓶 内，依次加入液体石蜡100mL、环己烷15mL和6滴Span 80，搅拌0.证后，加入上述壳聚糖溶 液，用水浴锅将体系加热至，搅拌lh，加入质量分数为25%的戊二醛3mL ；用10% NaOH 溶液调PH值至10，然后升温至65°C，继续反应池后，趁热用真空抽滤泵将得到的微球滤 出，用蒸馏水反复水洗后，再用石油醚和无水乙醇洗涤，真空干燥至恒重，制得壳聚糖骨架， 90%颗粒粒径分布在125 200 μ m。实施例2壳聚糖接枝称取0. 5g实施例1得到的产品，经水充分溶胀后，依次用20 %、50 %、70 %的DMSO 水溶液清洗；向处理后的产物中加入27mL DMSO/NaOH溶液(DMS0体积分数为0. 4，NaOH水 溶液浓度为0. 4mol/L)和环氧氯丙烷，使环氧氯丙烷的体积分数为10 %，振荡反应4h，反应 温度为50V。反应结束后用大量蒸馏水冲洗，直至清洗液中无环氧基检出。壳聚糖环氧基 修饰密度采用硫代硫酸钠滴定法测定，其环氧基修饰密度达到0. ImmoVg0实施例3壳聚糖接枝称取0. 5g实施例1得到的产品，经水充分溶胀后，依次用20 %、50 %、70 %的DMSO 水溶液清洗；向处理后的产物中加入27mL DMSO/NaOH溶液(DMS0体积分数为0. 5，NaOH水 溶液浓度为0. 4mol/L)和环氧氯丙烷，使环氧氯丙烷的体积分数为6%，振荡反应3h，反应 温度为40°C。反应结束后用大量蒸馏水冲洗，直至清洗液中无环氧基检出。壳聚糖环氧基 修饰密度采用硫代硫酸钠滴定法测定，其环氧基修饰密度达到0. 089mmol/go实施例4壳聚糖分离介质的制备将50mL IDA/NaOH混合溶液(IDA和NaOH的浓度分别为1. Omo 1/L)加入实施例2 制得的接枝后的微球，60°C温度下反应池，将得到的产品抽滤即可。Cu2+螯合量的测定准确称取一定量制得的壳聚糖分离介质，加入同体积同浓度 (0. lmol/L)的CuSO4溶液中螯合Cu2+，真空抽滤后，测定滤液中残留Cu2+的量即可知Cu2+螯 合量。分光光度法(波长为660nm)测定溶液中铜离子含量，Cu2+螯合量达到162. 0mg/g。牛血清白蛋白(BSA)吸附容量的测定取制得的壳聚糖分离介质lmL，以5mL、 10mg/mL的BSA上柱，流速20mL/h，以0. 05mol/L、pH7. 5的Tris-HCl缓冲液洗脱，在线监 控收集洗脱液，测定洗脱液中蛋白，得BSA吸附容量。BSA浓度的测定采用考马斯亮蓝法 (595nm)。BSA的最大吸附量达到128. 0mg/g。实施例5壳聚糖分离介质的制备将50mL IDA/NaOH混合溶液(IDA和NaOH的浓度分别为1. Omo 1/L)加入实施例3 制得的接枝后的微球，60°C温度下反应池，将得到的产品抽滤即可。Cu2+螯合量和BSA吸附量的测定方法同实施例4，结果显示采用分光光度法(波 长为660nm)测定Cu2+螯合量，其螯合量达到103. 8mg/g ；利用考马斯亮蓝法(595nm)测定 BSA含量，其最大吸附量达到89. 2mg/go
权利要求
1.一种适于蛋白纯化的壳聚糖分离介质的制备方法，包括如下步骤(1)在搅拌下，将壳聚糖的乙酸溶液分散于液体石蜡中，在制孔剂环己烷和少许span 80存在下，形成壳聚糖微粒；然后在交联剂戊二醛的作用下，壳聚糖微粒进一步交联形成 壳聚糖骨架；(2)壳聚糖骨架先进行溶胀处理；然后在DMSO/NaOH混合液中，壳聚糖骨架上的羟基与 环氧氯丙烷反应，在壳聚糖骨架上引入环氧基，得到接枝后的壳聚糖骨架；(3)将IDA/NaOH混合溶液加入接枝后的壳聚糖骨架，20 80°C温度下反应1 10h， 抽滤即得所述的壳聚糖分离介质；所述IDA/NaOH混合溶液中，IDA浓度为0. 5 3mol/L， NaOH 浓度为 0. 5 3. Omol/L0
2.如权利要求1所述的适于蛋白纯化的壳聚糖分离介质的制备方法，其特征在于所 述的步骤(1)具体如下将壳聚糖溶解在质量分数为1. 0 3. 0%的醋酸溶液中配制得到 浓度为0. 01 0. 05g/mL的壳聚糖溶液；在反应容器中依次加入液体石蜡、环己烷和少许 Span 80，搅拌30 60min后加入配制得到的壳聚糖溶液，加热至20 80°C搅拌0. 5 1. 5h ；然后加入戊二醛，调节pH至8 12，然后升温至30 80°C，继续反应2 6h，趁热 抽滤、洗涤、干燥得到壳聚糖骨架；所述壳聚糖溶液与液体石蜡的投料体积比为1 0.5 5，所述交联剂戊二醛与壳聚糖氨基的摩尔比为1 0.1 10，所述制孔剂环己烷与液体石 蜡投料体积比为5 50 100。
3.如权利要求2所述的适于蛋白纯化的壳聚糖分离介质的制备方法，其特征在于所述 的步骤(1)中，所述壳聚糖溶液与液体石蜡的投料体积比为1 1 3;所述交联剂戊二 醛与壳聚糖氨基的摩尔比为1 0.5 3;所述制孔剂环己烷与液体石蜡的投料体积比为 10 30 100。
4.如权利要求2所述的适于蛋白纯化的壳聚糖分离介质的制备方法，其特征在于所述 的步骤(1)中，加入配制得到的壳聚糖溶液后先加热至50 60°C搅拌0. 5 1. Oh ；然后加 入戊二醛，调节pH至9 10，然后升温至60 70°C，继续反应2. 5 4h。
5.如权利要求1所述的适于蛋白纯化的壳聚糖分离介质的制备方法，其特征在于所述 的步骤( 具体如下称取壳聚糖骨架，经水充分溶胀后，依次用体积分数为10% 100% 梯度浓度的二甲基亚砜溶液清洗；向处理后的产物中加入DMSO/NaOH溶液和环氧氯丙烷， 在20 80°C振荡反应1 10h，反应结束后用蒸馏水清洗，直至清洗液中无环氧基检出； 所述DMSO/NaOH混合液由DMSO与0. 1 1. Omol/L的NaOH水溶液按照体积比1 0. 1 10. 0配制得到；所述环氧氯丙烷与DMSO/NaOH混合液的投料体积比为1 20 100。
6.如权利要求5所述的适于蛋白纯化的壳聚糖分离介质的制备方法，其特征在于所述 的步骤O)中，所述DMSO/NaOH混合液由DMSO与0. 1 1. Omol/L的NaOH水溶液按照体 积比1 0. 5 2. 0配制得到；所述环氧氯丙烷与DMSO/NaOH混合液的投料体积比为5 15 100。
7.如权利要求5所述的适于蛋白纯化的壳聚糖分离介质的制备方法，其特征在于所述 的步骤O)中，在40 50°C振荡反应，反应时间3 证。
8.如权利要求1所述的适于蛋白纯化的壳聚糖分离介质的制备方法，其特征在于所述 的步骤(3)中，反应温度为55 65°C，反应时间为3 他。
全文摘要
一种适于蛋白纯化的壳聚糖分离介质的制备方法，包括如下步骤(1)在搅拌下，将壳聚糖的乙酸溶液分散于液体石蜡中，在制孔剂环己烷和少许span 80存在下，形成壳聚糖微粒；然后在交联剂戊二醛的作用下，壳聚糖微粒进一步交联形成壳聚糖骨架；(2)壳聚糖骨架先进行溶胀处理；然后在DMSO/NaOH混合液中，壳聚糖骨架上的羟基与环氧氯丙烷反应，在壳聚糖骨架上引入环氧基，得到接枝后的壳聚糖骨架；(3)将IDA/NaOH混合溶液加入接枝后的壳聚糖骨架，20～80℃温度下反应1～10h，抽滤即得所述的壳聚糖分离介质。本发明所述的壳聚糖分离介质在很大程度上解决了金属离子泄露的问题，具有工艺稳定性及重现性好等优点，适宜规模化生产。
文档编号B01J20/30GK102068965SQ20101057942
公开日2011年5月25日 申请日期2010年12月9日 优先权日2010年12月9日
发明者崔国艳, 应国清, 易喻, 梅建凤, 王鸿, 陈建澍 申请人:浙江工业大学