用于黄曲霉毒素净化的多功能磁性纳米粒子及其制备方法与流程

本发明属于黄曲霉毒素净化处理技术领域，具体涉及一种用于黄曲霉毒素b1、b2、g1、g2净化的多功能磁性纳米粒子，并进一步公开其制备方法。

背景技术：

黄曲霉毒素(aft)是公认的天然强致癌物质之一，其中以黄曲霉毒素b1(aftb1)毒性最大。黄曲霉毒素b1为黄曲霉菌、寄生曲霉毒产生的代谢产物，具有致癌、致畸、致突变的作用，是迄今发现的最稳定的一种真菌毒素。目前一般的食品加工条件都不易破坏其毒性，因此给食品安全埋下了巨大的隐患。各国对食品中黄曲霉毒素的残留非常重视，制定了相应的限量标准。

目前，用于黄曲霉毒素b1、b2、g1、g2的净化技术主要有免疫亲和柱、多功能净化小柱等。传统的多功能净化小柱是以极性、非极性及离子交换等基团组成填充剂，可选择性吸附样液中的脂类、蛋白质类等杂质，毒素不被吸附而直接通过，从而达到对多种毒素的净化处理。但是由于这些多功能精华小柱填充颗粒多为直径较大的微米球，比表面积相对较小，官能团固载量较低，造成低的净化效率；同时这些净化柱价格昂贵，且多为一次性使用，这使得分析成本较高、耗时较长，严重制约了对食品中黄曲霉毒素b1、b2、g1、g2的安全监测和净化。

对于黄曲霉毒素的净化而言，有关对磁性纳米粒子进行修饰，并应用于磁性纳米粒子分离纯化的研究已有报道。磁性纳米材料是20世纪80年代出现的一种新型材料，研究和开发新型纳米磁性材料已经引起世界各国的广泛兴趣。磁性纳米粒子具有超高的比表面积，大大提高了官能团的固载量，且易于进行化学修饰以实现多种用途。经修饰后的磁性纳米粒子能够与被测试样品相结合，在外加磁场的作用下可以快速从复杂的样品中实现分离，因此净化效率更高、成本更低。

中国专利cn102680673a公开了一种用于净化黄曲霉毒素样本的免疫磁性微粒，是将黄曲霉毒素b1抗体与磁性微粒共同反应一段时间后，制备出具有特异性的免疫磁性微粒，可实现黄曲霉毒素亲和吸附到免疫磁性微粒表面。又如中国专利cn104959114a分别公开了一种将黄曲霉毒素b1核酸适配体与磁性微粒偶联，制备所得具有特异性的免疫磁性微粒，可用于样品中黄曲霉毒素b1的分离纯化。上述两种免疫磁性微粒能够有效分离净化黄曲霉毒素b1，并改善了分离效率；但是上述免疫磁性微粒均是仅仅针对黄曲霉毒素b1的净化制得，其只能够净化黄曲霉毒素b1而对其他真菌毒素无作用，这也间接使得对整体毒素的净化效率略低。因此，对于复杂样品中微量的多种真菌毒素的快速、有效的分离净化仍是亟待解决的问题。

技术实现要素：

为此，本发明所要解决的技术问题在于提供一种用于黄曲霉毒素b1、b2、g1、g2净化的多功能磁性纳米粒子，以解决现有技术中净化黄曲霉毒素的磁性颗粒净化效率较低的问题。

为解决上述技术问题，本发明所述的用于黄曲霉毒素净化的多功能磁性纳米粒子，所述磁性纳米粒子包括：

由磁性纳米粒子构成的内核层；

包覆所述内核层的烷化层；

由多功能官能团修饰的外壳层。

所述硅烷化层沿靠近所述内核层方向包括第一硅烷化层和第二硅烷化层；所述第一硅烷化层为四乙氧基硅烷层；所述第二硅烷化层为甲基丙烯酰氧丙基三甲氧基硅烷层。

所述硅烷化层为由四乙氧基硅烷和甲基丙烯酰氧丙基三甲氧基硅烷键合包覆的硅烷化层。

所述外壳层为苯乙烯-二乙烯苯-甲基丙烯酸缩水甘油酯修饰层。

所述磁性纳米粒子为顺磁性的fe3o4磁性纳米粒子。

本发明所述黄曲霉毒素是指黄曲霉毒素b1、b2、g1、g2。

本发明还公开了一种制备所述的用于黄曲霉毒素净化的多功能磁性纳米粒子的方法，包括如下步骤：

(1)取所述磁性纳米粒子，在外加磁场下洗涤所述磁性纳米粒子，并冷冻干燥；

(2)使用选定的硅烷化试剂制得所述硅烷化层；

(3)取选定的多功能官能团经反应制得所述外壳层，即得。

具体的，所述的制备所述的用于黄曲霉毒素净化的多功能磁性纳米粒子的方法，包括如下步骤：

(1)通过共沉淀技术，制备出fe3o4磁性纳米粒子，在外加磁场下，洗涤磁性纳米粒子，冷冻干燥；

(2)使用反相微乳液中的溶胶-凝胶法制备四乙氧基硅烷包裹的磁性纳米粒子，之后用甲基丙烯酰氧丙基三甲氧基硅烷对硅胶表面进行化学修饰引入双键；

(3)在水相中进行乳液聚合，以苯乙烯、甲基丙烯酸缩水甘油酯为单体、二乙烯苯为交联剂、过硫酸钾为引发剂、十二烷基硫酸钠为表面活性剂，反应后经水洗制备得到多功能团修饰的磁性纳米粒子复合物。

本发明还公开了所述的用于黄曲霉毒素净化的多功能磁性纳米粒子用于制备黄曲霉毒素净化剂的用途。

本发明还公开了一种净化黄曲霉毒素的方法，包括如下步骤：

(1)按照所述方法制得所需多功能磁性纳米粒子；

(2)取含有黄曲霉毒素的待净化样本加入甲醇-水或乙腈-水溶液混合进行提取；

(3)将所述多功能磁性纳米粒子加入上述步骤(2)的混合液中进行反应，捕获含有的黄曲霉毒素b1、b2、g1、g2，反应结束后，反应液经磁性分离，上清液即为含有所述黄曲霉毒素的样本。

所述黄曲霉毒素优选为牛奶中的黄曲霉毒素b1、b2、g1、g2。

所述的净化黄曲霉毒素的方法，还包括所述磁性纳米粒子再生的步骤，具体包括：将所述步骤(3)中磁性分离得到的磁性纳米粒子，加入至甲酸甲醇或甲酸乙腈洗脱液中振荡混合，并经磁性分离将所述磁性纳米粒子吸附的杂质洗脱，分离后的所述磁性纳米粒子重悬于水中保存。

本发明所述多功能磁性纳米粒子以顺磁性fe3o4磁性纳米粒子为内核层，并在其所述内核层包覆特定硅烷化试剂形成的硅烷层，以及在其表面修饰使其表面键合多功能团。所述磁性纳米粒子具有加大的比表面积，对多种官能团的固定化容量很高，可有效捕获牛奶中的黄曲霉毒素b1、b2、g1、g2，样品净化效率高，分离效率和回收率高达80％-90％。

本发明所述多功能磁性纳米粒子，在磁性纳米颗粒表面包覆一层惰性的无机或者有机材料，保护纯金属磁性纳米颗粒免受空气中氧气的侵蚀问题。所述硅胶外壳不仅可以隔绝活性内核和外界环境，还提供了较高活性的硅羟基表面以便进一步修饰，同时避免了修饰试剂和磁性纳米粒子直接接触导致的磁性、光学性质的降低。本发明所述磁性纳米粒子选择聚(苯乙烯-二乙烯苯-gma)(psd)作为硅胶层的外壳包裹层，合成具有多层核-壳结构的磁性纳米粒子。所述psd聚合物的优点是利用三组分之间的混合优势：聚苯乙烯-二乙烯苯可以提供合适的交联聚合物，而且这种聚合物本身具有表面性质均匀、外形光滑，无孔的特点，非常适合做聚合物基质；gma作为一种含有环氧的单体分子，极性相对较大，而另外聚苯乙烯-二乙烯苯为弱极性物质，强极性与弱极性基质的同时存在可以更好的去除牛奶样品中脂肪、蛋白质等物质，对黄曲霉毒素的萃取效率更高。所以，本发明所述磁性纳米粒子选用适合包裹的psd聚合物，具有较好的外形、分散性控制以及较好的稳定性。

本发明所述多功能磁性纳米粒子，用于黄曲霉毒素b1、b2样品净化分离过程简单便捷，并可在外磁场作用下进行分离，容易回收再生。同时，所述磁性纳米粒子在净化样品时，只需要对样品进行简单的处理，不需要高速离心和固相萃取的活化处理，也不存在堵塞和反应后分离困难的问题，还可以根据实验调整反应体积，整个方法简单易行。

附图说明

为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明，其中，

图1为本发明所述磁性纳米粒子的透射电镜图；其中，图a和图b为所述顺磁性fe3o4磁性纳米粒子的透射电子显微镜图；图c和图d为所述的表面带有硅胶的磁性纳米粒子(fe3o4@sio2)的透射电子显微镜图；图e和图f为所述的多官能团修饰的磁性纳米粒子(fe3o4@sio2@pgma)透射电子显微镜图；

图2为本发明所述磁性纳米粒子的红外光谱图，其中，曲线a为所述顺磁性fe3o4磁性纳米粒子的红外光谱图；曲线b为所述的表面带有硅胶的磁性纳米粒子的红外光谱图(fe3o4@sio2)；曲线c为所述的多官能团修饰红外光谱图(fe3o4@sio2@psd)。

具体实施方式

实施例1制备多功能磁性纳米子

本实施例所述多功能磁性纳米子包括：

由顺磁性的fe3o4磁性纳米粒子构成的内核层；

包覆所述内核层的第一硅烷化层(四乙氧基硅烷层)，以及包覆所述第一硅烷化层的第二硅烷化层(甲基丙烯酰氧丙基三甲氧基硅烷层)；

由苯乙烯-二乙烯苯-甲基丙烯酸缩水甘油酯多功能官能团修饰的外壳层。

本实施例所述多功能磁性纳米子按照如下方法制备：

(1)fe3o4磁性纳米粒子的合成

取2.705g六水合氯化铁(10.0mmol)、0.995g四水合氯化亚铁(5.0mmol)，溶于10ml用脱气去离子水配制0.4m盐酸中，超声15min使其充分溶解，用机械搅拌器搅拌。另配100ml0.4m的氢氧化钠水溶液，也用氦气脱气，氮气保护下，氢氧化钠溶液用恒压加料漏斗缓慢均匀的加入体系，室温下反应。氢氧化钠溶液加完后，体系在氮气保护下放入80℃油浴加热反应30min。冷却到室温后，将反应体系于4℃、13500rpm离心10min，去上清后加入100ml0.1m盐酸水溶液浸泡，然后将溶液于4℃、13500rpm离心10min并去上清，再加入100ml乙醇浸泡粒子，并将溶液于4℃、13500rpm离心10min去上清，以去掉未反应的碱和其他杂质。残留的固体物质用20ml去离子水超声30min，之后将反应液于4℃、13500rpm离心30min后取上清，最终得到20ml黑色的磁性纳米粒子分散体系，测定其含量为10mg/ml，在氮气保护下4℃保存，备用；

对上述所得的fe3o4磁性纳米粒子的形貌进行检测，图1中a和图1中b显示了所述顺磁性fe3o4磁性纳米粒子的透射电子显微镜图；

(2)硅烷化修饰(fe3o4@sio2)磁性纳米粒子的合成

在一个干燥干净的250ml广口瓶中，将123.2ml环己烷与25.6ml正己醇超声混合，用氦气脱气5min，然后加入称量好的28.3gtritonx-100，磁力搅拌5min，随即加入3.28ml之前制备的fe3o4磁性纳米粒子分散体系，常温搅拌20min使之充分形成黑亮均匀的微乳液。另取1.6ml四乙氧基硅烷(teos)用注射器一次性加入反应体系，搅拌10min使之充分溶解，然后加入0.96ml浓氨水(25-27％wt)，室温下搅拌反应20h。反应完毕，用200ml无水乙醇淬灭微乳液体系，淬灭过程需要几分钟，然后将反应液于24℃、7830rpm离心2min，去上清后取固体物质用100ml无水乙醇超声5min重悬，然后将重悬液于24℃、7830rpm离心3min，去上清并以乙醇洗涤的过程重复3-4次，直至上清液清亮透明为止，以充分除去粒子表面吸附的表面活性剂tritonx-100。固体物质洗涤完毕超声15min重悬于150ml无水乙醇中，抽换氮气三次，并在100℃沸水中回流处理3h。反应完毕冷却室温后，将粒子离心收集，在一个干燥的250ml广口瓶中，将粒子超声15min重新分散于100ml干燥无水乙醇中，然后加入1ml硅烷化试剂甲基丙烯酰氧丙基三甲氧基硅烷(mps)，于35℃油浴中反应48h，待反应完毕后于24℃、7830rpm离心3min，收集粒子并用无水乙醇洗涤4次，每次均超声5min并重悬，然后于24℃、7830rpm离心3min，收集所得的硅烷化修饰粒子。洗涤完毕后，将所得粒子真空干燥，并于4℃保存；

对上述表面硅烷化修饰的磁性纳米粒子的形貌进行检测，图1中c和图1中d显示了所述的表面带有硅胶的磁性纳米粒子的透射电子显微镜图；

(3)多功能(fe3o4@sio2@psd)磁性纳米粒子的合成

取30mg上述mps修饰的fe3o4@sio2磁性纳米粒子，分散于1ml乙醇溶剂中，超声30min充分分散。另取15ml去离子水用氦气脱气，然后加入称量好的3mgsds，超声5min充分溶解。然后将上述1ml乙醇分散的fe3o4@sio2磁性纳米粒子加入体系中，抽换氮气三次，超声5min。反应体系入油浴加热，待温度升到40℃后，注射器慢慢加入超声混匀的混合单体(含1ml苯乙烯，0.1mlgma，0.04ml二乙烯苯，各单体均用碱性氧化铝过滤)，磁力搅拌下升温，待体系温度升到75℃时，注射加入0.5ml过硫酸钾溶液(kps，0.02g/ml)，控制温度稳定在75℃，反应17h，待体系颜色由黑变灰，并逐渐发红。反应完毕后体系磁分离，收集固体，固体物质用水洗三次。洗涤完毕将粒子分散于20ml去离子水中，氦气脱气，加入0.1mlgma，抽换氮气三次，油浴加热。待混度升到80℃，加入0.1ml过硫酸铵溶液(10％wt)，温度维持80℃反应12h。反应完毕粒子变红，反应体系用磁力分离，所得固体粒子用水洗两次，得到所需fe3o4@sio2@psd磁性纳米粒子，然后超声分散于20ml水中，4℃保存；

对上述多功能磁性纳米子复合物的形貌进行检测，图1中e和图1中f显示了所述多官能团修饰的磁性纳米粒子的透射电子显微镜图，所示的每个独立的多功能磁性纳米粒子中，深色区域显示为内核层，浅色区域显示为外壳层。

分别对所述的fe3o4磁性纳米粒子、所述表面硅烷化修饰的磁性纳米粒子及所述多功能磁性纳米子复合物的结构进行检测，图2中曲线a为所述顺磁性fe3o4磁性纳米粒子的红外光谱图；曲线b为所述的表面带有硅胶的磁性纳米粒子的红外光谱图；曲线c为所述的多官能团修饰红外光谱图。实施例2制备多功能磁性纳米子

本实施例所述多功能磁性纳米子包括：

由顺磁性的fe3o4磁性纳米粒子构成的内核层；

包覆所述内核层的烷化层，所述硅烷化层由四乙氧基硅烷和甲基丙烯酰氧丙基三甲氧基硅烷键合包覆；

由苯乙烯-二乙烯苯-甲基丙烯酸缩水甘油酯多功能官能团修饰的外壳层。

本实施例所述多功能磁性纳米子按照如下方法制备：

(1)fe3o4磁性纳米粒子的合成

所述fe3o4磁性纳米粒子的合成同实施例1步骤(1)；

(2)硅烷化修饰(fe3o4@sio2)磁性纳米粒子的合成

硅烷化修饰(fe3o4@sio2)磁性纳米粒子的合成同实施例1步骤(2)，其区别仅在于将两种硅烷化试剂共同添加进行键合；

(3)多功能(fe3o4@sio2@psd)磁性纳米粒子的合成

所述多功能(fe3o4@sio2@psd)磁性纳米粒子的合成步骤同实施例1步骤(3)。

应用例1

本应用例以实施例1所制备的多功能磁性纳米粒子提取牛奶样品中黄曲霉毒素b1、b2、g1、g2。

所述待净化样本的制备包括：分别在空白牛奶样品中添加10g/kg、20g/kg、50g/kg的黄曲霉毒素b1、b2、g1、g2，平行添加5个样品。

所述净化牛奶样品中黄曲霉毒素b1、b2、g1、g2的方法包括如下步骤：

(1)分别量取上述制得的待净化牛奶样本5ml，加入10ml水-乙睛溶液(4：6，v/v)，涡旋混合2min，超声处理15min，静置后每个样本取1ml上清液，备用；

(2)分别向上述每个上清样本中加入实施例1制得的多功能磁性纳米粒子10mg，振荡反应30min，并在反应后在外加磁场作用下，磁性分离得到上清液和磁性纳米粒子；

(3)将磁性分离后的磁性纳米粒子加入至5ml甲酸甲醇(1+99，v/v)溶液中，解脱出黄曲霉毒素，洗脱氮气吹干，并加入200ml三氟乙酸于50℃衍生5min后，于50℃吹干衍生试剂，用流动相定容至1.0ml，待hplc-fld分析；

(4)将步骤(3)中分离的磁性纳米粒子保存在脱气水中。

将上述处理后的样品，进行hplc-fld分析，结果见下表1。

所述黄曲霉毒素的hplc-fld评价方法检测条件包括：

色谱柱：c18，4.6×150mm，5m；

柱温：30℃；

流动相：乙睛+甲醇+水(13+12+75)；

流速：1.0ml/min；

进样量：20.0l；

洗脱方式：等度洗脱；

荧光检测条件：激发波长，365nm，发射波长，440nm。

表1多功能磁性纳米粒子复合物应用于牛奶中黄曲霉毒素的加标回收率和重复性

上述数据可知，经测定本发明所述磁性纳米离子对黄曲霉毒素b1、b2、g1、g2的回收率均达到80％以上，相对标准偏差小于10％，说明该纳米材料适用于牛奶实际样品中黄曲霉毒素的净化。

另在空白牛奶样品中添加20g/kg黄曲霉毒素b1，平行添加5个，使用同一份多功能磁性纳米粒子，经上述步骤(1)-(4)处理后，其添加回收率分别是86％、84％、80％、81％，说明该纳米材料具备良好的再生性。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。